В комплекс диагностических исследований входит:
1) сбор анамнестических данных;
2) клиническое исследование молочной железы;
3) лабораторные методы исследований молока;
4) бактериологические исследования секрета вымени.
У коров в период запуска и сухостоя обращают внимание на общее состояние коров и молочной железы. При этом пальпируют каждую четверть вымени. При осмотре выдоенного секрета учитывают изменение его цвета и консистенцию во время запуска и травостоя. Все показатели клинического обследования и лабораторного анализа секрета из отдельных четвертей вымени сравнивают между собой. У нетелей проводят осмотр вымени и анализ секрета за 2 месяца до отела. Согласно рекомендациям по борьбе с маститом при клинически выраженном мастите коров исследуют ежедневно при доении, а для диагностики скрыто протекающего воспаления вымени — 1 раз в месяц.
У овец, свиноматок и кобыл обычно исследуют лишь бактериологический секрет больных четвертей вымени, что позволяет дифференцированно подходить к выбору антибиотиков при лечении больных животных.
1) Собирая анамнестические данные, выясняют: когда заболело животное, как проходили последние роды, каким было состояние молочной железы в предыдущую лактацию и в сухостойный период, какой применялся метод доения и тип доильной установки (правильность ее работы).
2) Клинический осмотр начинают с исследования общего состояния животного (температура, пульс, дыхание), затем исследуют вымя путем его осмотра, пальпации, пробного доения, определения качества молока. Вымя осматривают сзади и сбоку, при этом обращают внимание на его форму, плотность, местную температуру тела, болезненность прикосновений к молочной железе, сохранность волосяного покрова, окраску кожи; выявляют травмы или их следы, заболевания кожи. При пальпации необходимо выявлять состояние надвыменных лимфатических узлов. При воспалительных процессах, особенно инфекционной этиологии, надвыменные лимфатические узлы могут быть увеличены в размерах, болезненны, неподвижны, уплотнены.
При визуальном определении качества молока учитывают наличие в нем фибринозных сгустков гноя, крови и других примесей. Это значительно легче определить по фильтру после процеживания молока, но целесообразнее провести лабораторные исследования его.
Биохимический анализ сыворотки крови проводят в ветеринарной лаборатории, а затем используют эти данные при составлении рациона кормления больных маститом. Лабораторный анализ секрета молочной железы предусматривает определение цвета, консистенции, запаха, сгустков и хлопьев (проба отстаивания), щелочности (пробы с индикаторными карточками, бромтимоловым синим, мастидином и димастидином), примеси лейкоцитов (лейкоцитарная проба), крови. Кроме того, в секрете вымени можно выявить ферменты (каталаза, редуктаза), содержание лизоцима (мурамидазы) и др.
1. Определение примесей. Молоко для лабораторного исследования берут следующим образом. Первые 2—3 мл секрета удаляют, а затем выдаивают молоко в пробирки, одинаковые по диаметру и цвету стекла, на пластмассовую пластинку с углублениями (лунками). Порции секрета сравнивают между собой по цвету и консистенции; при этом можно уловить примесь крови, хлопьев и сгустков. Для определения примесей можно пропустить молоко через сеточку или марлю; примеси остаются на их поверхности. Пробы секрета в пробирке можно оставить в холодильнике на 1 сутки. Молоко из здорового вымени осадка не образует.
2. Определение щелочности секрета. Бромтимоловая проба. Используют 0,25% раствор бромтимолсинего в 65% спирте. В углубления пластинки выдаивают по 2—5 капель молока и добавляют 2—5 капель реактива. Молоко из здоровых окрашивается в желтоватый цвет, из больных — в зеленый с разными оттенками или синий.
Проба с индикаторными карточками. Индикаторные или маститные карточки представляют собой бумажные пластинки, на которые нанесен индикатор в виде 4х желтых пятен. На каждый кружок выдаивают 2-3 капли молока; цвет бумажных кружков изменяется в зависимости от щелочности молока — желтоватый, зеленоватый с разными оттенками или синий.
Проба с димастидином. Используют молочно-контрольные пластинки (МКП-1 и МКП-2). МКП-1 имеет четыре (по числу четвертей) полушаровые луночки с черно-белыми кольцевыми углублениями, которые соответствуют 1 и 2,5 мл молока. Контрастное окрашивание дна луночек облегчает выявление хлопьев и крови. Для проведения пробы с димастидином готовят 5%-ный раствор димастидина на дистиллированной или кипяченой теплой воде. В каждое углубление пластинки надаивают по 1 мл молока и добавляют 1 мл приготовленного раствора димастидина из бутылки с пипеткой-автоматом. Смесь молока с реактивом перемешивают палочкой в каждой лунке поочередно, в течение 10—15 сек. При использовании пластинки МКП-2 молоко с реактивом смешивают одновременно во всех лунках путем горизонтального вращения пластинки. Реакцию учитывают по густоте желе и изменению цвета. Образование желе — основной диагностический признак при исследовании молока по димастидиновой и мастидиновой пробам, а изменение цвета — ориентирующий признак.
Проба с 2% раствором мастидина. Готовят 10% и 2% растворы мастидина. Ставят пробу и учитывают реакцию по образованию сгустка и изменению цвета, как при исследовании молока с 5% раствором димастидина. Показания проб с димастидином или мастидином в обязательном порядке нужно подтверждать пробой отстаивания.
Проба с маститдиагностом. В состав маститдиагноста входят дистиллированная вода — 100 мл, сульфанол — 30 г, трипо-лифосфот — 5 г, бромтимолсиний — 0,02 г, 1% раствор кислоты — 0,5 мл. Молоко для пробы берут в конце доения или из сборного молока. В луночках молочно-контрольной пластинки смешивают 1 мл молока с 1 мл реактива. Наличие плотного желеобразного сгустка тягучей массы или редко слизи свидетельствует о положительной реакции на скрытый мастит.
Проба отстаивания выполняется с молоком, давшим положительный результат на димастидин и мастидин. Берут в пробирку 10 мл молока и помещают на 16—18 ч в холодильник или другое холодное место, чтобы молоко не прокисло. На второй день пробы осматривают и учитывают результаты. Лучше это делать при дневном свете. Обращают внимание на наличие осадка, количество и характер сливок, цвет молока.
3. Лейкоцитарная проба проводится в специальных пробирках с суженным концом. Пробирку заполняет молоком до метки 10 и центрифугируют в течение 5 мин при 2 тыс. об/мин. В случае заболевания маститом уровень осадка достигает 1 и более. Из осадка делают мазок, окрашивают по Граму и просматривают под микроскопом. В случае мастита в осадке секрета можно обнаружить микробы, лейкоциты, гнойные тельца.
4. Проба с бензидином для выявления в молоке пигментов крови. В пробирку наливают 5 мл 3% раствора перекиси водорода и 2 мл насыщенного раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте. После тщательного взбалтывания в смесь прибавляют 2-10 капель молока. Положительная реакция — смесь окрашивается сначала в зеленый, а через минуту в темно-синий цвет; отрицательная — смесь светлая с беловатым хлопьевидным осадком.
5. Определение каталазы с помощью бумажного диска. Из хроматографической бумаги фильтра Ф-1 готовят диски диаметром 12 мм и 3% раствор перекиси водорода на М/15 фосфатном буфере, рН 7,2 (готовят в день проведения пробы).
Анатомическим пинцетом захватывают бумажный диск и погружают его в тщательно смешанную пробу молока; для удаления излишка секрета диск поворачивают в вертикальное положение и, притрагиваясь к стенкам пробирки, как бы вытирают его. После этого диск погружают в раствор перекиси водорода, 5 мл которого наливают в пробирку. При малом содержании лейкоцитов время всплытия диска равно 1-5 мин, а иногда и более. При увеличении лейкоцитов диск всплывает за 30-35 сек., при заболевании маститом — за 3-5 сек. или моментально. В одной пробирке с одним и тем же реактивом можно проводить до 10 анализов.
6. Определение лизоцима (мурамидазы). Вымя обмывают, высушивают его полотенцем, кожу соков дезинфицируют 70%-ным спиртом и берут в стерильные пробирки молоко по 5 мл: на МПА в чашки Петри высеивают суточную бульонную культуру золотистого стафилококка (молочная вена). Для этого культуру разводят физиологическим раствором 1:10 000 и 0,1 мл равномерно распределяют по чашке и оставляют на 1 ч. Затем в агаре каждой чашки делают 4—6 луночек диаметром 10 мм. В каждую лунку вносят стерильной микропипеткой по 0,1 мл молока. Чашки выдерживают при комнатной температуре (18—22 °С) 18 ч, а затем помещают в термостат на 5—6 ч; если молоко содержит лизоцим М, то вокруг луночки происходит задержка роста стафилококков в виде кольца. Измерив диаметр кольца задержки роста микроба, определяют титр лизоцима молока.
Диагностика субклинического (скрытого) мастита. Выдаивают секрет в лунки молочно-контрольной пластинки с последующим добавлением одного из реактивов (2% мастидин, 2% мастотест Воронежский, 5% димастин или 2,5% сульфанол). Густоватый в начале секрет при смешивании с реактивом становится жидким. О наличии скрытого мастита свидетельствует образование сгустка. Секрет здоровых животных сгустка не образует. Также диагностируют путем исследования молока с одним из быстрых диагностических тестов (БМТ) - пробы с димаститом, мастидином, мастотестом Воронежским и др. Действие быстрых маститных тестов основано на выявлении увеличенного количества лейкоцитов и изменения рН молока.
Диагностика мастита в запускной и сухостойный периоды. В последний день запуска всех коров исследуют клинически. При отсутствии клинических признаков (увеличение доли, болезненность, изменение секрета, повышение местной температуры) болезни исследуют секрет из каждой доли вымени по быстрому маститному тесту и пробой отстаивания. В сухостойный период коров исследуют на мастит дважды: первый раз через 10-15 дней от начала сухостоя, второй - за 10-15 дней до отела при переводе животных в родильное отделение. При выявлении клинических признаков заболевания проводят пробное доение. В течение первых 20-30 дней сухостойного периода в вымени здоровых коров секрет жидкий, серовато-белого цвета однородной консистенции без каких-либо включений. Во второй половине периода секрета в вымени мало (3-5 см3), он вязкий, тягучий, клейкий (медообразный), желто-коричневого цвета (редко секрет серовато-белого цвета), иногда секрет выдоить не удается. Наличие клинических признаков или изменения количества и внешнего вида секрета свидетельствует о клинически выраженном мастите.
studfiles.net
После перемешивания каждой пробы проверяли органолептические показатели молока : цвет,запах, консистенцию, вкус (после кипячения) .Затем измеряли температуру молока в соответствии с ГОСТ 25754-85 «Молоко. Методы измерения температуры».
Прежде всего отбирали пробы молока для контроля бактериальной обсемененности, затем для физико-химических исследований. Отбор проб для микробиологических исследований , а также собственно исследования проводили по ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа». Пробы для физико-химических исследований маркировали, консервировали и хранили в соответствии с ГОСТ 13928-84.
Для установления сортности в средних пробах молока в соответствии с ГОСТ 13264-88 определяют жирность, кислотность, плотность, степень чистоты, бактериальную обсемененность .
Титруемую кислотность молока определяли по ГОСТ 3624-92. Определение массовой доли, жира, плотность молока, и СОМО проводил с помощью прибора «Лактан».
Технические характеристики
Время измерения, мин не более 3
Габариты,мм 80 х 120 х 300
Масса,кг …......1,3
Диапазон измерения :
жира,%........................................0-20
СОМО, %.....................................................6-12
плотности кг/м3...............................1000 -1040
объем пробы, см...............................20
Тепловую пробу проводили по методике Т.Владыкиной и В. Вайткусу.
36
В таблице проведены данные рациона фермы и личного подворья.
Таб лица 2.4.
| Наименование показателей | Рацион содержит, на личном подворье | % к норме | Рацион содержит, на ферме | % к норме | Норма |
| Кормовые единицы | 14,94 | 136 | 11,4 | 104 | 11,0 |
| Перевариваемый протеин г | 1580 | 174 | 827 | 91 | 910,0 |
| Сахар г | 2054,4 | 265 | 807 | 104 | 775,0 |
| Кальций г | 150,6 | 221 | 81,4 | 131 | 62,0 |
| Фосфор г | 55,6 | 129 | 42,5 | 99 | 43,0 |
| Магний г | 52,4 | 262 | 41,3 | 207 | 20,0 |
| Калий г | 309 | 435 | 214,5 | 302 | 71,0 |
| Сера г | 42,3 | 184 | 23,6 | 103 | 23,0 |
| Железо мг | 1418 | 190 | 745,0 | ||
| Медь мг | 146,2 | 183 | 48,9 | 61 | 80,0 |
| Цинк мг | 513 | 95 | 322,3 | 60 | 538,0 |
| Кобальт мг | 118,6 | 1944 | 5,1 | 84 | 6,1 |
| Марганец мг | 1419 | 264 | 389,8 | 72 | 538,0 |
| Йод мг | 9,69 | 138 | 4,2 | 60 | 7,0 |
| Каратин мг | 360 | 90 | 892 | 224 | 398,0 |
| Витамин Д | 14400 | 155 | 4430 | 48 | 9300,0 |
| Витамин Е | 1710 | 460 | 1053 | 283 | 372,0 |
ллдл
Из данных таблицы видно, что рацион, получаемый коровами, содержащихся у частников более каллорийный, чем у коров, содержащихся на ферме СПК «Восход». Кроме того, на ферме рацион рассчитывают, исходя из молочной продуктивности за год всего поголовья в целом. Хозяйки, кормят своих животных учитывая, удой каждой коровы за день.
В рационах уточняют количество перевариваемого протеина, разнообразие ингредиентов, соотношение сочных и концентрированных
37
кормов, присутствие незаменимых аминокислот, сахаропротеиновое соотношение, наличие и соотношение кальция и фосфора, натрия и калия, микроэлементов: J, Со, Мп, Zn, Fe, Си и др. Роль микроэлементов в организме самок разнообразная и многогранная. Так, к образованию фолликулярных кист яичников располагает недостаток йода из-за нарушений взаимосвязи между щитовидной железой, гипофизом и яичниками, когда угнетается лютеинизирующая функция гипофиза. Появляются анавулярные половые циклы, аборты и задержания последа. Минимальная суточная потребность в нем для коров 0,3-0,6 мг на 1 кг сухого вещества рациона.
Кобальт входит с состав В12, при его недостатке наблюдается анемия, залеживание, скрытые аборты, задержание последа, субинволюция матки. При избытке кобальта повышается выделение йода с мочой. Потребность 1 мг на 1 кг корма в сутки.
Недостаток марганца в организме вызывает неполноценность половых циклов, низкую оплодотворяемость из-за угнетения гонадотропной функции гипофиза. Потребность для коров в сутки 40-60 мг на 1 кг сухого корма. В отсутствии недостаточного количества в рационе развивается анемия, а снижение содержания гемоглобина в крови наблюдают при недостатке меди.
Микроэлементы выполняют роль биохимических катализаторов, входя в состав многих гормонов, витаминов, ферментов или активизируют их.
Содержание микроэлементов в почвах и растениях колеблется, поэтому их вводят в рационы с учетом анализа почв.
Недостаток витаминов отражается на воспроизводство животных, особенно витаминов А, Д Е и группы В. Гиповитаминозы возникают при недостаточном содержании в кормах отдельных витаминов или при их недостаточном усвоении организмом, например, в следствии заболеваний пищеварительных органах, нарушений обмена веществ, интоксикации и др.
При недостатке витамина А снижается общая резистентность организма, происходят дегенеративные изменения в яичниках, половые циклы протекают без овуляции, затрудняются имплантация зигот, если
38
происходит оплодотворение. Недостаток витамина В1 - тиамина - ослабляет течение родов у беременных коров и вызывают послеродовые осложнения. Отсутствие рибофлавина ( витамин В2) ведет к выпадению волос, кератоконъюнктивитам, пиридоксина (витамин В6) - к нервным расстройствам, а недостаток цианкобаламина ( витамин В12) к нарушениям функции печени и селезенки.
Витамин С предохраняет от кровотечения из половых органов, дистрофии половых желез, развития субинволюции матки. При недостатке витамина D развиваются гипофункция и атрофия яичников. Этот витамин обладает эстрогенным действием, для его усвояемости необходимо воздействие на организм ультрафиолетовых лучей. Показателем насыщенности организма животного витамином является щелочная фосфатаза.
Авитаминоз и гиповитаминоз Е приводят к скрытому аборту или эмбриональной гибели зигот. Понижение плодовитости у животных на почве неполноценного кормления наступает особенно быстро в тех случаях, когда организм располагает малыми запасами питательных веществ, что приводит к персистенции желтых тел яичников, гипофункции и фолликулярным кистам яичников.
studfiles.net
Определение азотсодержащих веществ. Азотсодержащие вещества в молоке представлены синтезированными высокомолекулярными соединениями, а также промежуточными и конечными продуктами азотистого обмена веществ, количество которых существенно изменяется в зависимости от функционального состояния молочной железы, что используется при оценке качества молока и диагностике патологических процессов в молочной железе.
а) Общего белка методом Кьельдаля
Метод предназначен для проведения государственных испытаний приборов, а также для разработки ускоренных методов определения общего белка.
Метод основан на сжигании органических компонентов пробы молока в колбе Кьельдаля в присутствии серной кислоты, а освобождавшийся при этом азот определяют титрованием и по его количеству вычисляют содержание общего белка
Подготовка к анализу:
1)Приготовление раствора натрия гидроокиси.
500г натрия гидроокиси растворяют в 1000мл дистиллированной воды. При применении в качестве катализатора красной окиси ртути в раствор натрия гидроокиси добавляют 12г сульфата натрия(Nа2S•9Н2О).
2)Приготовление двойного индикатора.
2г метилового красного и 1г метилового голубого растворяют в 1000мл 96%этилового спирта.
Проведение анализа:
1)В колбу Кьельдаля помещают последовательно несколько стеклянных бусинок или кусочков фарфора, 10г калия сернокислого,0,5г окиси ртути или 0,04г сернокислой меди. В бюксу отмеривают5мл молока, взвешивают с точностью до 1мг, по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы устанавливают массу взятого молока.
В колбу добавляют 20мл серной кислоты, закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое.
2)Колбу ставят в нагревательный прибор под углом 45°и осторожно нагревают до тех пор, пока не прекратится пенообразование и содержимое колбы не станет жидким. Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагревании. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы.
Периодически содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок. Нагревают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и практически бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при катализаторе сернокислой меди).
3)После осветления раствора нагревание продолжают в течение1,5ч, затем дают остыть до комнатной температуры. Добавляют 150 мл дистиллированной воды и несколько кусочков свежеприготовленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают
4)В коническую колбу отмеривают 50мл борной кислоты, добавляют 4капли индикатора и .перемешивают. Коническую колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резиновой трубки так, чтобы конец аллонжа был ниже поверхности раствора борной кислоты в конической колбе.
5)Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным цилиндром отмеривают 80мл раствора натрия гидроокиси, и через делительную или капельную воронку вносят его в колбу Кьельдаля. Сразу же после выливания раствора закрывают кран делительной воронки во избежание потерь образующегося аммиака.
Содержимое колбы осторожно смешивают круговыми движениями и нагревают до кипения. При этом избегают пенообразования.
Продолжают перегонку до тех пор, пока жидкость не начнет вскипать толчками. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не менее 20мин. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20мл) в течение 5мин. Окраска раствора борной кислоты, должна оставаться без изменений. При перегонке не допускается нагревание раствора борной кислоты в конической колбе. Перед окончанием перегонки опускают коническую колбу так, чтобы конец аллонжа оказался под поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2мин.
Прекращают нагревание, отсоединяют аллонж, в коническую колбу омывают внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа небольшим количеством дистиллированной воды.
6)Титруют дистиллят 0,1н раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в фиолетовый.
Параллельно проводят контроль анализа так же,как и основной, применяя 5мл дистиллированной воды вместо молока.
Обработка результатов
Массовую долю общего белка (X)в процентах вычисляют с точностью до третьего десятичного знака по формуле
1,4х 0,1К (V1-Vо)х6,38
Х=--------------------------------------
m
где, 1,4 -количество азота, эквивалентное 1мл 0,1н раствора соляной кислоты, мл;
0,1 -нормальность раствора соляной кислоты;
К -коэффициент поправки раствора соляной кислоты;
V1 -объем 0,1н НСl, израсходованной на титрование дистиллята в основном анализе, мл;
V0 -объем 0,1н НС1,израсходованной на титрование в контрольном анализе, мл;
6,38 -коэффициент перевода массовой доли общего азота на массовую долю общего белка;
m -масса молока, взятого для анализа, г.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 0,03%.
б) Общего белка пробой с нейтрализованным формалином и едким натром
Подготовка к анализу:
1)Нейтрализация формалина.
На 100мл 36-40% раствора формалина добавляют 0,5мл 2% раствора фенолфталеина и по каплям вносят раствор щелочи (30-40%), а в конце нейтрализации -0,1н раствор едкого натра до появления слабо-розовой окраски.
Лучше нейтрализовать небольшую порцию формалина и использовать ее для анализа в течение одного дня. Как недостаточная, так и излишняя нейтрализация формалина приводит к ошибке. Формалин хранят в темном месте при температуре б-9°С. При долгом хранении формалина в условиях низкой температуры появляется осадок. Пользоваться таким формалином можно после фильтрации его через бумажный фильтр.
2)Приготовление сернокислого кобальта.2,5г сернокислого кобальта вносят в мерную колбу емкостью100мл и доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора сернокислого кобальта -не больше б месяцев.
Проведение анализа:
В химический стакан отмеривают 20мл молока, добавляют 2,5мл 2% спиртового раствора фенолфталеина и нейтрализуют 0,1н раствором едкого натра (без учета количества его) до появления розовой окраски, совпадающей с цветом эталона. Для получения эталона в стакан такой же емкости отмеривают 20мл того же молока и 1 мл раствора сернокислого кобальта.
Затем в стакан с молоком вносят 4мл 36-40% раствора нейтрализованного формалина, перемешивают круговыми движениями и через1мин титруют из бюретки 0,1н раствором едкого натра до появлений розовой окраски, которая должна совпадать с цветом эталона. Количество децинормального раствора едкого натра отсчитывают с точностью до 0,05мл. Делают не менее двух параллельных определений, расхождения между которыми не должны быть более 0,05мл щелочи.
Обработка результатов:
Количество 0,1н раствора едкого натра, затраченного на титрование пробы молока после добавления формалина, умножают на коэффициент 0,959и округляют до 0,001.Полученное произведение показывает содержание общего белка в молоке в процентах.
в) общего белка с помощью приборов
Используют датские электронные приборы «Промилк МК 2», «Милко-Скан 100», «Милко-Скан 203», «Милко-Скан 300 “.
В молоке клинически здоровых коров количество общего белка составляет 3,3-4,I%в зависимости от породы. При воспалительном процессе в молочной железе количество общего белка возрастает.
г) азота и аммиака реактивом Несслера.
Приготовление реактива Несслера:
30г ртути двуйодистой, 26г калия йодистого растирают в ступке с 30мл дистиллированной воды и переносят в мерный цилиндр со 160мл 50% раствора едкого натра. По окончании бурной реакции ступку ополаскивают, содержимое цилиндра доводят дистиллированной водой до 1л. Реактив выдерживают 3-4суток в темном месте, после чего он готов к употреблению.
Проведение анализа:
1) Определение общего азота.
Пробу молока разводят дистиллированной водой 1:100.К 0,25 мл разведенного молока добавляют 0,5мл 10% раствора серной кислоты и подогревают для минерализации. Когда раствор значительно потемнеет, добавляют по каплям перекись водорода до посветления и подогревают 3-5мин. для окончательной минерализации. После охлаждения приливают 3,5мл дистиллированной воды и 1,5мл реактива Несслера. Сразу после добавления реактива определяют оптическую плотность на приборе «Спекол» при длине волны 470нм.
Обработка результатов:
Полученную цифру оптической плотности умножают на 10 000.
2)Определение азота сыворотки молока
К 10мл обезжиренного центрифугированием (при 6тыс. оборотах в 1мин) в течение 10мин молока добавляют 400 мг сульфосалициловой кислоты, хорошо перемешивают и ставят в холодильник на 1ч. Осадок отцентрифугируют в течение 5мин при 3тыс. оборотах в 1 мин. Подученную сыворотку разводят в 20раз дистиллированной водой. Затем проводят минерализацию и определяют оптическую плотность как при определении общего азота.
Обработка результатов:
Полученную цифру оптической плотности умножают на 200.
3) Определение остаточного азота.
К 1мл сыворотки молока, полученной на предыдущем этапе, добавляют 1мл дистиллированной воды и 2мл 10%раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и выдерживают в холодильнике 2ч. После чего отцентрифугируют при 3тыс. оборотах в 1мин. в течение 5мин. Затем проводят минерализацию и определяют оптическую плотность как при определении общего азота.
Обработка результатов:
Полученную цифру оптической плотности умножает на 100.
4)Определение аммиака
Анализу подвергают молоко не ранее чем через 2ч после окончания доения. В стакан отмеривают 20мл молока, нагревают в водяной бане до 40-45°С, добавляют 1мл 10%уксусной кислоты, оставляют для осаждения казеина на 10мин. Пипеткой отбирают 2мл отстоявшейся сыворотки, переносят в пробирку, добавляют 1мл реактива Несслера и содержимое сразу же перемешивают, наблюдая при этом в течение не более 1мин изменение окраски смеси.
Обработка результатов:
Чувствительность метода составляет 6-9мг% аммиака. Появление лимонно-желтой окраски смеси указывает на присутствие аммиака, характерного для молока.
Появление оранжевой окраски различной интенсивности указывает на наличие аммиака выше его естественного содержания.
д) мочевины по цветной реакции с диацетилмонооксимом.
Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в молоке.
Подготовка к анализу:
Реактивы.
1)Приготовление 25% раствора диацетилмонооксима. 250 мг вещества растворяют в 9,75 мл дистиллированной воды. Реактив стоек.
2)Приготовление основного раствора хлорного железа. 5 г хлорного железа растворяют и доводят дистиллированной водой до 100 мл, затем прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты.
3)Приготовление рабочего раствора хлорного железа. 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до 100 мл дистиллированной водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85% ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 недель.
4) Приготовление раствора тиосемикарбазида. 250 мг тиосемикарбазида или 320 мг тиосемикарбазида соляно-кислого растворяют соответственно в 97,5 и 96,8 мл дистиллированной воды, получают 0,25% и 0,32% растворы.
5)Приготовление цветного реактива. К 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 25% раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 0,25% раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением.
6)Приготовление стандартного 0,025% раствора мочевины.
Берут 250мг мочевины, в сушильном шкафу при температуре 105°С доводят до постоянного веса, а затем растворяют в 1л дистиллированной воды. В качестве растворителя можно использовать 0,2% раствор бензойной кислоты (0,2г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100мл дистиллированной воды при интенсивном помешивании и нагревании на водяной бане).Стандарт, приготовленный на растворе бензойной кислоты, более стабилен, чем водный. При работе на ФЭК оба раствора должны давать небольшое количество экстинции. В противном случае готовят новый стандартный раствор.
10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ)
Оборудование:
1.Фотоэлектроколориметр.
2.Центрифуга.
3.Водяная баня.
4.Центрифужные пробирки.
5. Алюминиевая фольга.
Проведение анализа:
Обезжиривание молока. Для этого его центрифугируют 20 мин при 4000-5000об/мин, верхний слой (жир) удаляют, а оставшуюся часть сливают в пробирку, закрывают резиновой пробкой и хранят в холодильнике.
В центрифужную пробирку вносят 0,8мл дистиллированной воды,0,2мл обезжиренного молока и 1мл 10% раствора ТХУ. Перемешивают и оставляют на 10-20мин. Центрифугируют 15-20мин при3000об/мин. В чистую пробирку вносят 0,5мл прозрачной надосадочной жидкости и 5мл цветного реактива. Пробирку закрывают резиновой пробкой, обернутой алюминиевой фольгой, выдерживают в кипящей водяной бане 80мин (точно) и охлаждают под струёй горячей воды. Измерение проводят на ФЭК при длине волны 500-600нм (зеленый светофильтр) против контроля в кювете с толщиной слоя 1см не позднее чем через 15мин после охлаждения.
Контроль ставят, как и опытную пробу, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5мл дистиллированной воды. Одновременно определяют мочевину в стандартной пробе. Стандартную пробу обрабатывают аналогично опытной, но вместо обезжиренного молока берут 0,2мл стандартного раствора мочевины.
Обработка результатов:
Расчет проводят по формуле.
Е оп
Х = ------------- х 25,
Е ст
где Х -концентрация мочевины, мг%
Еоп -экстинция опытной пробы;
Ест -экстинция стандартной пробы;
25 -концентрация мочевины в стандартном растворе, мг%
В молоке клинически здоровых коров содержание мочевины составляет 20-40мг%,в молозиве первого удоя - 15-20мг%, молозиве 5-го дня —18-24 мг%.
е) Электрофоретическое определение сывороточных белков.
В щелочных буферных растворах большая часть белков ведет себя как кислота и движется к аноду. Скорость движения различных белков в электрическом поле различная. Сывороточные белки молока путем электрофореза можно разделить на четыре основных группы: сывороточный альбумин, бета-, альфа-лактоглобулины, иммунные глобулины. При рН 7,9все эти белки в электрическом поле движутся к аноду, так как они при этом становятся отрицательно заряженными.
Наиболее быстро движется сывороточный альбумин, затем бета-лак-тоглобулин, за ним альфа-лактоглобулин, наконец, иммунные глобулины.
Оборудование:
Прибор для электрофореза на бумаге.
Центрифуга.
3)Холодильник.
4)Потенциометр (рН-метр).
5) Пипетки и микропипетки.
Реактивы:
Приготовление 20% раствора уксусной кислоты. 200 мл ледяной уксусной кислоты вносят в мерную колбу объемом 1л и доливают до метки дистиллированной водой.
Приготовление веронал-оксалатного буфера рН 7,9.
Раствор № 1: 36,8г веронала и 24мл 30% раствора едкого натра растворяют в дистиллированной воде, доводя общий объем до 2 л.
Раствор № 2: 4,5г щавелевой кислоты растворяют в дистиллированной воде, доводя объем до 1л.
Раствор № 3: 1560мл раствора № 1смешивают с 480мл раствора № 2.Если рН ниже 7,9,добавляют несколько капель щелочи, при более высоком рН -щавелевокислую кислоту.
3) Приготовление раствора красителя. 100мг кислотного сине-черного красителя растворяют в 450 мл этилового спирта, добавляя в него 50мл ледяной уксусной кислоты, или0,2г бромфенолового синего и 1г хлористой ртути растворяют в 100мл 2% раствора уксусной кислоты, или2г хлористого аммония, 10г каломеди, 1г бромфенолового синего растворяют в 1л дистиллированной воды. Профильтровать и использовать через сутки.
4)Растворы для отмывания электрофореграмм.
100мл ледяной уксусной кислоты и 40г перегнанного фенола доводят дистиллированной водой до 1л, или50мл ледяной уксусной кислоты доводят дистиллированной водой до 1л.
5)0,1н едкий натр
Проведение электрофореза:
Для исследования берут 30-40 мл молока, подогревают до 40°С и центрифугируют при 1500-2000об/мин в течение 10мин.
Молоко помещают в холодильник на 10-15мин, после чего пипеткой или шпателем снимают жир. Следы жира (0,2-0,З%), оставшиеся в молоке, не мешают дальнейшему анализу.
Для отделения казеина к обезжиренному молоку добавляют по каплям 20% уксусную кислоту, доводя реакцию молока до рН 4,6 (изоэлектрическая точка казеина). При этом происходит более полное осаждение казеина. Реакцию молока проверяют потенциометром или универсальным индикатором. Выпавший осадок отделяют фильтрованием. Казеин отделяют в день взятия пробы молока, так как при хранении в холодильнике в течение 1-2суток изменяется соотношение фракций белка.
Молочную сыворотку используют для электрофоретического анализа. Перед проведением электрофореза кюветы камеры заполняют буфером, доводя до одинакового уровня. Электроды полностью помещают в буферный раствор.
Для электрофореза используют хроматографическую фильтровальную бумагу № 4,выпускаемую Санкт-Петербургской фабрикой им. Володарского. Полоску бумаги размером 3х40см или 4х32см помещают в камеру за 1-1,5ч до нанесения сыворотки для увлажнения.
Сыворотку молока в количестве 0,08мл наносят дробно в 4 приема на полоску, отступя от катодного конца 10см.
Электрофорез проводят в следующем режиме: напряжение 300В, сила тока - 0,3мА/см, градиент потенциала - 5В/см, время - 6 ч.
По окончании электрофореза прибор выключают. Электрофореграммы сушат при 100°С 10мин в горизонтальной плоскости.
Окрашивают раствором кислотного сине-черного или бромфенолового синего в течение 15мин.
Для удаления красителя, с безбелковых участков электрофореграммы промывают от кислотного сине-черного красителя 10% раствором уксусной кислоты с перегнанным фенолом;бромфенолового синего –5% раствором уксусной кислоты.
11) Для установки соотношений белковых фракций сыворотки молока электрофореграмму разрезают на отдельные выявленные фракции. Кусочек бумаги, соответствующий каждой фракции, измельчают, помещают в пробирку с 5-10мл 0,1н едкого натра и элюируют в течение1ч. Для элюирования бета-лактоглобулиновой фракции берут вдвое больший объем 0,1н едкого натра. Оптическую плотность раствора красителя в элюиате измеряют на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 630нм). Контролем служит эталон элюиата из участка электрофореграммы, не содержащего белка.
Обработка результатов:
Процентное содержание каждой фракции белка вычисляют по соотношению между показателями оптической плотности данной фракции и суммы показателей оптической плотности всех фракций, которую принимают за 100,с учетом двукратного увеличения показателя для фракции бета-лактогобулинов.
На стартовой линии выявляют неидентифицированную фракцию в виде одной иди двух полос (неподвижная фракция).Неподвижную фракцию выделяют в самостоятельную, так как она закономерно выявляется на всех электрофореграммах.
Пример. Показания ФЭК для сывороточного альбумина составляют 0,07,бета-лактоглобулина - 0,238х 2 = 0,476,альфа-лактоглобулина - 0,196,иммунных глобулинов - 0,262и неподвижной фракции -0,096.Сумма показателей оптической плотности - 1,100,а процентное соотношение фракций белка соответственно:
сывороточный альбумин - 0,070 - 6,4%
бета-лактоглобулин - 0,476 - 43,3%
альфа-лактоглобулин - 0,196 - 17,8%
иммунные глобулины - 0,292 - 23,8%
неподвижная фракция - 0,096 - 8,7%
1,100 -100%
В сыворотке молока больных маститом коров увеличивается содержание сывороточного альбумина и иммунных глобулинов по сравнению со здоровыми животными.
Определение лактозы
Лактоза (молочный сахар)образуется в молочной железе и ее количество изменяется в зависимости от функционального состояния органа, что используется при оценке качества молока и диагностике патологических процессов в молочной железе.
Используют датский электронный прибор «Милко-Скан 203». В молоке здоровых коров количество лактозы составляет 4,6-4,9%, в молозиве - 3,0-4,I%.При воспалительном процессе в молочной железе количество лактозы снижается.
Определение концентрации водородных ионов (рН).
Изменение рН молока происходит как при физиологической перестройке функции молочной железы (различные сроки лактации, период сухостоя), так и при патологических процессах, протекающих в этом органе. Повышение щелочности (рН больше 6,8)является ориентирующим признаком при постановке диагноза на мастит.
Концентрацию водородных ионов (рН) определяют с помощью приборов -рН метров и различных индикаторов.
а) Определение рН-метром
Используют рН-метр-милли-вольтметр ЛПМ-60 М, рН-метр-милли-вольтметр рН-340, рН-метр для молока и молочных продуктов рН 222,1и др.
В стаканчик наливают 2/3объема исследуемого молока, опускают в него измерительные электроды и по отклонению стрелки милливольтметра устанавливают по шкале величину рН.
б) Проба с бромтимоловым синим
Приготовление раствора бромтимолблау:
0,5г бромтимолблау растворяют в 50мл этилового спирта и добавляют 50мл дистиллированной воды.
Проведение анализа:
1)Проба на стекле. На поверхность предметного стекла наносят 1каплю исследуемого молока и добавляют 1каплю раствора бромтимолового синего. Учитывают цвет смеси.
2)Проба на молочно-контрольной пластинке. В луночки ПМК-1, ПМК-2, УОКМ-1 (устройство для определения качества молока) из соответствующих долей вымени надаивают по 1мл молока и добавляют по 1-2капли раствора бромтимолового синего. Учитывают цвет молока на месте контакта с индикатором.
Оценка результатов:
желтый, желто-зеленый -рН молока 6,3-6,8;
беловато-желтый, белый -рН молока меньше 6,3;
зеленый, синий -рН молока щелочная, больше 6,8.
Определение кислотности по Тернеру.
Кислотность является в основном показателем свежести и степени загрязненности молока. В конце лактации и при воспалении молочной железы кислотность молока (секрета) снижается.
Проведение анализа:
В коническую колбу вносят 10мл исследуемого молока, 20 мл дистиллированной воды и 3капли I%спиртового раствора фенолфталеина, перемешивают и титруют из бюретки 0,1н раствором едкого натра (или кали) до появления не исчезающего в течение 30с. слабо-розового окрашивания.
Обработка результатов:
Расчет ведут по формуле
Х =А х 10,
где х -количество молока вградусах Тернера;
А - количество мл 0,1н раствора едкого натра (или калия), пошедшего на титрование 10мл молока;
10 -коэффициент пересчета в градусы Тернера (количество мл 0,1н раствора едкого натра или калия, пошедшего на титрование 100мл молока).
Кислотность свежего молока от здоровых коров составляет в среднем 16-19°Т, молозива первого удоя -45-55°Т, седьмого дня -19.5°Т.
Определение кетоновых (ацетоновых) тел реактивом Лестраде. Кетоновые (ацетоновые) тела состоят из ацетона, ацетоуксусной кислоты, которые являются промежуточными продуктами обмена веществ в организме и могут увеличиваться при его нарушении не только в крови, моче, но и в молоке. Проводят определение как общего количества кетоновых тел, так и раздельно.
Приготовление реактива Лестраде:
1г натрия нитропрусида, 20г натрия углекислого безводного и 20г аммония сульфата смешивают и растирают в ступке до получения мелкого однородного порошка.
Хранят в темной посуде с плотно притертой пробкой.
Проведение анализа:
На фильтровальную бумагу наносят 0,2г реактива Лестраде и смачивают его 2-3каплями исследуемого молока. Через 40-60с учитывают цвет смеси.
Оценка результатов:
В молоке (молозиве) здоровых коров сумма кетоновых тел (бета-оксимасляная, ацетоуксусная кислоты, ацетон) составляет не более 8мг%.
Окраска смеси молока с реактивом Лестраде в сиреневый цвет свидетельствует о наличии в молоке (молозиве) более 10% кетоновых тел.
Определение пигментов крови
В молоке здоровых животных встречаются лишь единичные эритроциты. Увеличение их количества может быть следствием ушибов, травм, воспалительных процессов молочной железы, а также послеродового отека вымени, особенно у первотелок.
Химические пробы по обнаружению пигментов крови основаны на гемолизе эритроцитов и освобождении гемоглобина, который способен отнимать водород от гвояковой смолы, бензидина, пирамидона и других органических соединений и переносить его на перекись водорода с образованием окрашенных соединений.
а) Проба с гвояковой смолой
Приготовление раствора гвояковой смолы.
5г смолы растворяют в 95мл 90% этилового спирта.
Проведение анализа:
Готовят смесь 5% спиртового раствора гвояковой смолы (1мл) с перекисью водорода (0,5мл), которую осторожно наслаивают на исследуемое молоко, предварительно налитое в пробирку объемом 5 мл.
Оценка результатов:
При содержании в молоке гноя или пигментов крови на границе соприкосновения жидкости через 2-3мин образуется синее или темно-синее кольцо. При встряхивании вся жидкость окрашивается в темно-синий цвет.
Б) Проба с бензидином
Проведение анализа:
К смеси из 5мл 3% раствора перекиси водорода добавляют 2мл насыщенного раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте. Смесь тщательно взбалтывают и прибавляют в нее 2-10капель исследуемого молока.
Оценка результатов:
При наличии в молоке гноя или пигментов крови жидкость окрашивается сначала в зеленый цвет, а через 0,5-1мин -в темно-синий.
При отрицательной реакции жидкость будет светлая с беловатым хлопьевидным осадком.
в) Проба с пирамидоном
Проведение анализа:
В пробирку с 5мл молока прибавляют 1мл 50%-ного раствора уксусной кислоты, взбалтывают и добавляют 0,5мл 5%-ного спиртового раствора пирамидона, 6-8капель перекиси водорода.
Оценка результатов:
При положительной реакции жидкость окрашивается в светло-фиолетовый (аметистовый) цвет, что указывает на наличие пигментов крови.
Определение жира.
Жир молока является продуктом синтеза альвеолярного эпителия, и его количество определяется функциональной активностью секреторных клеток. К концу лактации и при воспалении молочной железы количество
жира в молоке (секрете) снижается.
1)Стандартный сернокислый способ
Способ основан на свойстве белков молока растворяться в серной кислоте, освобождения жира и образования амилово-серного эфира в присутствии изоамилового спирта.
Проведение анализа:
В молочный жирометр (бутирометр) наливают с помощью пипетки автомата 10мл серной кислоты плотностью 1,81-1,82(при 20°С), затем пипеткой медленно приливают 10,77мл молока и 1мл изоамилового спирта (плотность при 20° С - 0,811-0,812).При этом избегают смачивания горлышка жиромера. Жиромер плотно закрывают резиновой пробкой и встряхивают до полного растворения белка, на что указывает отсутствие белых крупинок. При встряхивании применяют меры предосторожности или специальные штативы.
После полного растворения белка жиромер ставят пробкой вниз в водяную баню при температуре 65° С на 5 мин,затем центрифугируют 5мин со скоростью не менее 1000об/мин. После центрифугирования движением резиновой пробки регулируют столбик жира в жиромере так, чтобы он находился в трубке со шкалой, и снова помещают в водяную баню при температуре 65±2°С на 5мин, затем жиромер вынимают из водяной бани и быстро производят определение жира.
Учет результатов:
Для определения количества жира жиромер держат вертикально, так, чтобы граница жира находилась на уровне глаз, и движением пробки вверх или вниз устанавливают нижнюю границу столбика жира на целом делении шкалы. От него отсчитывают число делений до нижней точки мениска столбика жира в процентах (каждое малое деление соответствует 0,I%жира, большое – I%жира).
Граница раздела жира и кислоты должна быть резкой, а столбик жира прозрачным. При невыполнении этих условий анализ проводят повторно.
2) Определение общих липидов с сульфофосфованиловым реактивом
Продукты распада ненасыщенных липидов образуют с реактивом состоящим из серной, ортофосфорной кислот и ванилина, окрашенное соединение. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в молоке.
Реактивы:
-Серная кислота концентрированная.
-85% фосфорная или ортофосфорная кислота.
-0,6% раствор ванилина. 0,6г ванилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, нагревая на водяной бане. После охлаждения объем доводят до 100мл, хранят при комнатной температуре.
-Фосфорнованилиновая смесь. К 4частям фосфорной кислоты (орто) добавляют 1часть 0,6%раствора ванилина. Хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре.
-Хлороформ для наркоза.
-Стандартный раствор триолеина. 500мг триолеина вносят в мерную колбу на 100мл и до метки доливают хлороформом. Тщательно перемешивают. Хранят в холодильнике, в посуде из темного стекла с притертой пробкой.
-Спирт этиловый абсолютный.
-Спирт метиловый.
Оборудование и аппаратура:
1)Фотоэлектроколориметр.
2)Водяная баня.
3)Весы аналитические.
4)Холодильник бытовой.
Проведение анализа:
В пробирку вносят 0,05мл молока и 5мл концентрированной серной кислоты. Тщательно перемешивают, предварительно закрыв пробирку пробкой, обернутой алюминиевой фольгой. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 10мин, затем охлаждают под струёй водопроводной воды.
В чистую пробирку вносят 0,4мл смеси, добавляют б мл фос-форнованилиновой смеси, тщательно перемешивают и оставляют на 45 мин в темноте при комнатной температуре. После этого фотометрируют на ФЭКе при длине воины 500-560нм (зеленый светофильтр № 6)в кювете с рабочей длиной 1см против контроля (вместо молока берут0,05мл дистиллированной воды и обрабатывают так же,как и молоко).
Одновременно обрабатывают 0,1мл стандартного раствора триолеина, как и опытную пробу.
Обработка результатов:
Расчет проводят по формуле
Еоп
Х = ———————х 500Х 2,
Ест
где Х -количество общих липидов, мг%;
Еоп - экстинция опытной пробы;
Ест -экстинция стандартного образца;
500 -концентрация липидов в стандарте, мг%
2 -фактор разведения;
Посуду необходимо мыть отдельно от другой. Пробирки и пипетки перед исследованием прополаскивают дистиллированной водой, а затем -этиловым и метиловым спиртом.
В молоке здоровых коров содержание жира колеблется в пределах 3,4-4,2%, в молозиве - 4,5-5,2%
Бактериологическое исследование секрета молчной железы
Бактериологическое исследование молока проводится для определения общей бактериальной загрязненности, выявления микроорганизмов, вызвавших заболевание молочной железы, определения чувствительности их к антимикробным препаратам, оценки результатов лечения больных животных
studfiles.net
