Как перестать путаться и выбрать правильное молоко

Говорят, что в современном мире приходится разбираться во всём: ежедневно мы вынуждены выбирать продукт из десятка аналогов, но не всегда понятно, на основании чего вообще стоит делать выбор. Зелёный портал помогает разобраться в том, какому молоку стоит отдать предпочтение и место в корзине.

Выбирая в магазине молоко, мы обращаем внимание на разные аспекты: компания-производитель, жирность продукта, тип обработки, упаковка. Относительно типов обработки молока существует огромное количество предрассудков и мифов. Впрочем, это неудивительно: страшилки, связанные с производством еды распространяются быстро, а искореняются долго и мучительно.

В ответ на любые данные проведённых проверок и научных исследований всегда можно предъявить непобедимый аргумент «ну а вдруг?». А вдруг это молоко «мёртвое», а вдруг оно вредное, а вдруг в нём инфекции и грибки?

Тем не менее, первый и главный факт о молоке, которое вы покупаете в магазине, — это то, что оно не сырое, и что это хорошо. Это значит, что вероятность заразиться какой-нибудь весьма неприятной болезнью гораздо ниже, чем если пить «самое чистое и живое» парное молоко, которое не прошло термической обработки.

Что касается общего влияния потребления молока на здоровье человека, то исследование «Молоко и молочные продукты: польза или вред для здоровья человека? Оценка совокупности научных данных», опубликованное в 2016 году, показало следующее: «Потребление молока и молочных продуктов связано со снижением риска развития детского ожирения. У взрослых потребление молока и молочных продуктов связано с нейтральным и пониженным риском развития сахарного диабета второго типа, снижением риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, особенно инсульта. Также есть данные о том, что потребление молока оказывает положительный эффект на минеральную плотность костной ткани, но не связано при этом с повышением риска переломов».

Невозможно сказать однозначно, какой тип обработки молока наилучший, потому что ответ будет зависеть в том числе и от того, как долго и при каких условиях вы собираетесь хранить молоко. Но мы вкратце расскажем вам о том, чет отличаются разные виды коровьего молока, которое вы можете купить в практически в любом продуктовом магазине. А выбирать уж придётся самим.

Цельное и питьевое

Цельное молоко подвергается только термическое обработке и никакой другой: его ни с чем не смешивают, его жирность не меняют. Грубо говоря, подоили корову, привезли молоко на завод, провели термообработку, упаковали и отправили в продажу.

А вот питьевое – это молоко, полученное из так называемого молока-сырья или даже восстановленное из сухого молока. К нему не могут добавлять немолочные компоненты, но могут уменьшать его жирность до необходимого уровня (этот процесс называется нормализацией, –молоко приводят в состояние, которое соответствует определённой норме). Как и цельное молоко, оно также обязательно подлежит термической обработке.

В общем, цельное молоко более «естественно» и «натурально». Но по словам Натальи Бацуковой, кандидатки медицинских наук и специалистки в области нутрициологии, если на упаковке написано просто «молоко», то это точно питьевое, а не цельное, так как закон не обязывает производителей указывать, что молоко – питьевое.

Нормализованное и восстановленное

Нормализованное молоко – это молоко, в котором скорректирована жирность. Как правило, жирность молока-сырья выше, чем у того молока, которое оказывается на прилавках, вот его и «нормализуют» – доводят до привычных нам 3,2%, 2,5%, 1,5% и даже делают обезжиренным. А вот восстановленное молоко и молоком-то назвать трудно: его получают, смешивая порошок или сгущёное молоко с обычной водой.

Наталья Бацукова отмечает, что такое молоко появляется в магазинах, как правило, зимой, когда не хватает цельного. Также она обращает внимание, что биологическия ценность у восстановленного молока ниже.

«Восстановленное молоко уступает нормализованному по биологической ценности за счет частичного разрушения при сушке молока под воздействием высоких температур витаминов, снижения доступности аминокислот и потерь других биологически активных веществ молока (гормонов, ферментов)».

Пастеризованное, стерилизованное и ультрапастеризованное

При пастеризации, по словам Натальи, в молоке сохраняется большая часть полезных составляющих (температура нагрева – не выше 95оС), но и портится оно быстрее, потому что из-за щадящего режима обработки в продукте остаются молочнокислые бактерии. Так что покупать такое молоко предпочтительно в тех случаях, если вы знаете, что выпьете его быстро.

Стерилизация молока происходит в результате достаточно длительной тепловой обработке (более 100оС), и это хорошо для длительного хранения, но в таком молоке, к сожалению, нет значительной части полезных веществ.

Ультрапастеризация – это своеобразный компромисс между пастеризацией и стерилизацией: молоко проходит обработку при температре 135-137оС, но время обработки – всего несколько секунд, после которых жидкость быстро охлаждается.

Оптимальность такого способа обработки молока Наталья объясняет следующим образом: «В молоке убивается микрофлора и споры бактерий, а природные полезные свойства сохраняются с минимальными потерями. Часто упаковка такого молока осуществляется в стерильных условиях (асептический розлив). Все это позволяет продлевать сроки годности молока без использования консервантов».

Также она отмечает, что использование консервантов в молоке запрещено законом.

Какую упаковку выбрать?

Выбор способа обработки – это только полбеды. Теперь надо разобраться с упаковкой. Молоко в полиэтиленовых пакетах, как правило, дешевле, чем аналогичное в другой таре, но какой выбор будет наилучшим с точки зрения экологии? К сожалению, в стеклянных бутылках молоко в магазинах сейчас не найти, но и из того, что имеется можно выбрать такую тару, которая будет не лежать десятилетия и даже сотни лет на полигоне, а переработается на заводе и будет повторно использована.

Сейчас в беларусских магазинах можно нати молоко в четырёх типах упаковки: один из них перерабатывается полностью, один – частично, и ещё два пока что не перерабатываются на территории Беларуси.

По данным Белстата, в 2015 году в нашей стране было произведено 743 кг молока на душу населения, и это был наибольший показатель среди стран СНГ. А в 2016 году мы занимали восьмое место по объёму произведённого молока в мире и вошли в пятёрку крупнейших мировых экспортёров этого продукта.

Планируется, что к 2020 году мы будем производить 9200 тонн молока в год. В общем, говорить о том, что всё произведённое в Беларуси молоко остаётся на территории страны, не приходится, но и недооценивать количество ежедневно выбрасываемой тары также не стоит.

Пластиковые бутылки

В беларусских магазинах молоко можно купить и в прозрачных, и в непрозрачных пластиковых бутылках из ПЭТ (полиэтилентерефталата) с крышкой из полипропилена или полиэтилена. Оба вида бутылок перерабатываются в нашей стране. По данным оператора вторичных материальных ресурсов Беларуси, с переработкой непрозрачных бутылок есть некоторые трудности, но несмотря на это, данный вид молочной тары стоит относить к самым экологичным.

Пакет из полиэтилена

Эта упаковка частично перерабатывается в Гомеле и Гродно (данные кампании «Цель 99»), а полученное вторсырьё используют в производстве полимерпесчаной плитки и люков. Если бы эти пакеты были сделаны из одного слоя плёнки, то перерабатывались бы они гораздо лучше, но молоко в них быстро бы портилось.

Существующий дизайн и особенности конструкции – не глупая бессмысленная прихоть, а своего рода вынужденная мера. В общем, дела с переработкой этих пакетов у нас обстоят не идеально, но уж точно лучше, чем со следующими двуми видами тары.

Тетра пак

С тетра паками в Беларуси всё сложно. Пока что они у нас не перерабатываются, но вроде бы есть надежда, что в ближайшие годы это может измениться.

В 2015 году компания «Белгипс-эко» анонсировала проект по раздельному сбору тетра паков. В Беларуси на тот момент не было (как нет и сейчас) собственного производста по переработке данного вида упаковки, и собранные тетра паки изначально стали отправлять в Россию.

Параллельно в Беларуси работали над тем, чтобы у нас открылось собственное аналогичное производство. Со временем стало понятно, что транспортировка тетра паков в РФ нерентабельна, и от неё отказались, так и не придумав ничего взамен.

Сейчас проект Белгипса приостановлен. Компания продолжает собирать тетра паки (есть специальные контейнеры и «карманы» на другие контейнеры) и хранит их в надежде, что местное производство по переработке данного вида отходов всё же будет в ближайшее  время запущено.

В целом, тетра паки имеют очень высокий потенциал для переработки, ведь это комбинированная упаковка, содержащая картон, полиэтилен и алюминий приблизительно в следующем соотношении: картон – 75%, полиэтилен – 20%, алюминий – 5%.

Полиэтиленовый кувшин

Как и тетра паки, полиэтиленовые кувшины в Беларуси не перерабатываются. Такая упаковка называется Lean Pack, и в 2010 году Интерфакс рекламировал её как инновационную и говорил, что использование этого вида тары – проявление того, что мировые и белорусские бренды заботятся об окружающей среде.

Но кампания «Цель 99», занимающаяся популяризацией переработки материалов в Беларуси, утверждает, что несмотря на заверения производителей упаковки, что она разлагается за полгода, научного подтверждения, что эти данные валидны для Беларуси, нет.

Проблема в том, что так называемые биоразлагаемые пластики требуют, как правило, специальным условий для быстрого разложения (солнечный свет, определённая влажность), которых нет на наши мусорных полигонах.

Нормализованное молоко

Молоко, как ни странно, продукт сезонный. Удои начинают повышаться с весны, достигают пика летом и к зиме значительно снижаются. Вы можете обойти десятки магазинов в поисках «настоящего» или «живого», или, как выражаются технологи, «сырого» молока, но так и не найти его. Вместо этого в молочных отделах будут красоваться пакетики от различных производителей с загадочными надписями: «нормализованное молоко» или «пастеризованное молоко». У нас, простых обывателей, это вызывает недоумение: что означает эта надпись?

А на самом деле все просто. Нормализованное молоко — это молоко, прошедшее обработку. Цель технологов на молочных заводах сводится к решению задачи номер один: не позволить молоку скиснуть максимально долго. И способов таких вполне достаточно. Самый жесткий и наиболее распространенный — стерилизация (многократное доведение до кипения). Второй способ — пастеризация. Способ уже более щадящий: 30 минут молоко выдерживается при температуре 65-70 градусов. Маркировка (значок) UHT говорит о высокотемпературных обработках: быстрое нагревание (за несколько секунд — 135 градусов), а затем — мгновенное охлаждение.

Но пастеризация — дело обычное для всего мира. А вот «возрождение» молока из порошка вызывает сомнения. И за словосочетанием «нормализованное молоко» зачастую скрывается именно такое псевдомолоко. Как объясняют это технологи?

Нормализованное молоко может быть двух видов.

1. Цельное свежее молоко в соответствии с определенной технологией доводится до жирности, установленной стандартом.

2. Нормализованное молоко (или рекомбинированное, или восстановленное) готовят из порошка. Вспоминается старая реклама соков «Инвайт» с забавной фразой «просто добавь воды». Здесь тот же принцип: производитель добавляет в порошковое молоко воду. Но почему-то забывает поставить в известность покупателя. Или не забывает?

Наличие порошка в купленной жидкости может показать лишь спектральный анализ. Обычный традиционный анализ результатов не даст. Здесь нужна только специальная экспертиза. Но те, кто знает вкус натурального молока, распознают его и по вкусу, без анализов: порошковое нормализованное молоко имеет сладковатый специфический привкус, свойственный лишь сухому молоку.

Странное дело — казалось бы, реализация молока на разлив выгодна всем: производителю, покупателю, продавцам. Молочные фермы постоянно сдают свежее молоко в магазины, покупатель точно знает, что молоко настоящее (цельное), а сами магазины получают (могли бы получать) процент с продаж больше, чем получают с пакетированного молока.

Но проблемы действительно есть.

Во-первых, молоко относится к продуктам скоропортящимся. Значит, оно может скиснуть, не успев доехать до прилавка. Это — убыток. Прямой.

Во-вторых, молоко, не обработанное термически, может преподнести «сюрпризы» в виде сальмонеллеза и туберкулеза. И если вдруг подозрение падет хотя бы на одно животное, придется остановить отправку товара полностью. Обработка же эти вопросы снимает.

В третьих, для торговли молоком на улице (на рынках) необходимо получить уйму различных справок и свидетельств. Причем для каждой партии. От разрешения ветеринарных служб до СЭС, которые подтвердят безопасность продукции. Это стоит денег. Все упирается в наличие времени и финансов. А молоко «ждать» не будет. Здесь сроки жесткие. Поэтому селянин вынужден сдавать молоко первому покупателю по предложенной, заведомо низкой, цене.

В проигрыше оказываются и поставщики молока (селяне), и потребители, лишенные возможности выбора. Получается, как в русских сказках: по усам вроде бы текло, да в рот не попало.

Остается надеяться лишь на порядочность производителей и не забывать внимательно читать надписи (особенно те, что с мелким шрифтом), с надеждой на то, что молоко нормализованное, которое перед нами на полке, относится к «виду №1» — цельному и свежему…

Молочные ингредиенты
| Сойтекс

Молочное сырье широко используется как в пищевой промышленности, так и в рационах животных. Наша компания работает с иностранными производителями из Южной Америки (Аргентина, Уругвай, Чили, Парагвай, Колумбия), Новой Зеландии, Турции. Мы предлагаем следующие молочные продукты:

МОЛОКО СУХОЕ ОБЕЗЖИРЕННОЕ

Сухое обезжиренное молоко представляет собой растворимый порошок, полученный путем удаления воды из пастеризованного обезжиренного молока. Это
натуральный диетический продукт жирностью не более 1,5%. Массовая доля молочного белка в обезжиренном
сухих веществ молока не менее 34%. Технологический процесс производства позволяет получать продукт высокой пищевой и вкусовой ценности, калорийности и усвояемости. Молоко сухое обезжиренное широко используется в производстве кондитерских изделий и кормов для животных.

МОЛОКО ЦЕЛЬНОЕ СУХОЕ

Сухое цельное молоко (СЦМ) производится из пастеризованного нормализованного коровьего молока путем удаления влаги с последующей распылительной сушкой. Это сухой молочный продукт с массовой долей сухих веществ молока не менее 96%, массовой долей молочного белка в сухих обезжиренных веществах молока не менее 34%, массовой долей молочного жира не менее 26%.
Сухое цельное молоко богато витаминами А, В, С, Е и РР, минеральными веществами — марганцем, йодом, железом, кальцием, калием, фосфором, натрием, селеном и другими. Оно содержит те же питательные вещества, что и обычное молоко.
Сухое цельное молоко часто используется в качестве пищевого продукта в хлебобулочных, кондитерских изделиях, а также в качестве добавки к колбасным и мясным изделиям. Он также используется в кормовой промышленности.

ЛАКТОЗА

Лактоза представляет собой молочный сахар в виде сухого порошка. Сырьем для его получения является молочная сыворотка, из которой отделяют молочный сахар, а затем обезвоживают с применением мембранной технологии и сушки. В период откорма лактоза является основным источником энергии. Широко используется в пищевой и фармакологической промышленности.

СУХАЯ СЫВОРОТКА

Содержит практически все виды водорастворимых солей и микроэлементов. Это делает его чрезвычайно полезным для человека и животных, а также незаменимым в производстве пищевых и косметических продуктов. Сухая сыворотка представляет собой мелкодисперсный сухой гигроскопичный порошок от белого до желтого цвета. Сухую сыворотку получают путем очистки, пастеризации, сгущения и сушки. Молочные продукты имеют особый состав и уникальные свойства. Основными компонентами сывороточных продуктов являются лактоза, белки и минеральные вещества. Сухая сыворотка является отличным источником минералов и витаминов, таких как витамины А, В2, РР, Н, органических кислот, фосфора, железа, йода, калия, кобальта и др.

МОЛОЧНЫЙ ПЕРМЕАТ

Молочный раствор является побочным продуктом процесса ультрафильтрации. Это единственный углевод животного происхождения с уникальными физико-химическими свойствами и высокой пищевой и биологической ценностью. Молочный пермеат широко используется в кондитерской и молочной промышленности, мясной и хлебопекарной промышленности, в производстве спортивного и детского питания, а также в производстве комбикормов.

МАСЛО МАСЛО

Масло — молочный продукт, содержащий жир и произведенный из коровьего молока.
Это калорийный и легкоусвояемый продукт с витаминами А и D. Широко используется в кондитерской и хлебопекарной промышленности. Предлагаем масло сладкосливочное 82,5% жирности и 72,5% жирности.

Обнаружение событий фосфорилирования методом вестерн-блоттинга — передовая практика

• На этой странице
• Обзор
• 10 советов, как обеспечить надежную генерацию данных и более чистые пятна
• использованная литература

Университет Вестерн Блот

Курсы, разработанные, чтобы сделать вас экспертом по вестерн-блоттингу.

Зарегистрироваться для участия в серии вебинаров ▸

Что такое R-петли?

Узнайте о противоречивой природе R-петлей, популярной области исследований рака.

Узнать больше ▸

Плакаты пути рака

Компиляция ключевых белков, участвующих в ключевых сигнальных путях: пути cGAS-STING, EGF R, mTOR, NF-kB и PI3/AKT.

Скачать или запросить копию ▸

Недавний блог

Балансирующий AKT: мутация горячей точки E17K и то, как она определяет рак

Читать сообщение в блоге ▸

Подпишитесь на нас:

Обзор

Передовая практика для обнаружения событий фосфорилирования методом вестерн-блоттинга

Скачать PDF

Ищете высокоспецифичное антитело для обнаружения событий фосфорилирования?

Новые фосфоспецифические антитела PrecisionAb компании Bio-Rad были проверены путем сравнения уровней фосфорилирования в обработанных и необработанных клеточных лизатах, а также путем дефосфорилирования мембран вестерн-блоттинга. Количественное определение уровня фосфорилирования позволяет быстро определить влияние клеточных обработок и дает простой способ оценить специфичность антител.

Узнать больше

Возможность исследовать события фосфорилирования белков и аберрантные уровни фосфорилирования имеет решающее значение для нашего понимания различных биологических и патологических процессов, особенно в исследованиях таких заболеваний, как рак. Однако обнаружение фосфорилированных белков в вестерн-блоттинге может быть сложной задачей.
В компании Bio-Rad мы разработали 10 советов, обеспечивающих надежное получение данных и более чистые блоты.

Темы включают:

• Ингибирование деградации белка и сохранение посттрансляционных модификаций во время пробоподготовки
• Селекция фосфоспецифических антител
• Определение общего белка
• Индукция фосфорилирования
• Лечение фосфатазой
• Концентрация образца
• Блокировка оптимизации
• Типы мембран
• Мойка
• Анализ нормализации общего белка (TPN)

1

Ингибирование деградации белка и сохранение посттрансляционных модификаций во время пробоподготовки

Разрушение клеточных мембран высвобождает ферменты, которые могут расщеплять и/или дефосфорилировать белки. Чтобы свести к минимуму их активность, вы должны хранить свои образцы на льду и предварительно охлаждать все буферы (Scopes, 1994). Мы также рекомендуем дополнять буферы для лизиса коктейлями ингибиторов протеаз и фосфатаз.

2

Селекция фосфоспецифических антител

При выборе фосфоспецифического антитела для ваших экспериментов крайне важно убедиться, что антитело специфически обнаруживает интересующий белок только тогда, когда он фосфорилирован в указанном сайте. Также важно убедиться, что антитело обнаруживает полосу с правильной молекулярной массой для вашего фосфорилированного целевого белка. Имейте в виду, что каждое фосфорилирование увеличивает молекулярную массу белка на 80 Да (Walsh 2006).

3

Определение общего белка

Использование антитела, определяющего общий уровень белка-мишени, позволяет определить фосфорилированную фракцию по отношению к общей фракции. Это позволяет сравнивать влияние различных видов лечения и обеспечивает внутренний контроль нагрузки (рис. 1А). Простой способ сделать это — мультиплексировать, чтобы вы могли одновременно смотреть на целевое общее количество и фосфопротеин (рис. 2). Посетите сайт bio-rad-antibodies.com/фосфо-прецизионаб для получения дополнительных примеров.

4

Индукция фосфорилирования

Возможно, вам придется стимулировать клетки перед сбором урожая, чтобы убедиться, что ваш белок фосфорилирован. Например, целевой белок может быть фосфорилирован в интересующем месте при активации определенного клеточного сигнального пути. В этом примере клетки обрабатывали эпидермальным фактором роста (EGF), чтобы вызвать фосфорилирование его рецептора EGF R по тирозину 1148 (фиг. 1B). После успешного лечения целевой белок будет фосфорилирован в интересующем месте.

Рис. 1. Вестерн-блот-анализ необработанных A431 и обработанных EGF лизатов целых клеток, зондированных (A) мышиным антителом против EGF R (VMA00061) или (B) мышиным антителом против EGF R (pTyr1148) (VMA00751) с последующим обнаружением с конъюгированным с HRP козьим антимышиным IgG (1/10 000, STAR207P). Мембраны обрабатывали (+) и без (-) протеинфосфатазы лямбда и визуализировали в системе визуализации ChemiDoc MP с экспозицией (A) 6 с или (B) 25 с.

Рис. 2. Флуоресцентное мультиплексирование позволяет количественно определить фосфопротеины на одном блоте. . Фосфоспецифический мышиный анти-EGF рецептор pSer1047 (VMA00746) и анти-тотальный кроличий анти-EGF рецептор инкубировали вместе. Добавляли hFAB Rhodamine Anti-Tubulin с флуоресцентными вторичными антителами. Флуоресцентные изображения были получены с использованием системы визуализации ChemiDoc MP Imaging.

5

Лечение фосфатазой

Обычный контроль фосфоспецифических антител включает обработку ваших лизатов кишечной фосфатазой теленка или протеинфосфатазой лямбда. Если антитело является фосфоспецифическим, сигнал исчезнет после обработки фосфатазой (рис. 1). Лямбда-протеинфосфатаза может быть использована для удаления фосфорилирования как серина/треонина, так и тирозина, а также остатков фосфотирозина фосфатазы кишечника телят.

6

Концентрация образца

При изучении относительно редкого случая фосфорилирования следует использовать наименьший объем буфера для лизиса, возможный для концентрирования образца. В качестве альтернативы, если известно субклеточное расположение интересующего вас белка, например, если ваш белок локализован в ядре, вы можете выполнить клеточное фракционирование и использовать исключительно ядерную фракцию для вестерн-блоттинга. Вы также можете рассмотреть возможность иммунопреципитации (IP) с использованием антитела, нацеленного на интересующий вас белок, независимо от состояния фосфорилирования.

7

Блокировка оптимизации

Выберите лучший блокирующий реагент для вашего антитела. Для анализа фосфорилированных мишеней рекомендуется начинать с казеина в TBS или BSA. Использование молока может привести к более высокому фону, поскольку оно содержит белки, которые могут мешать идентификации фосфорилированных белков-мишеней. Другие блокирующие реагенты, такие как куриный овальбумин, рыбий желатин и коммерчески доступные синтетические блокирующие реагенты, также могут представлять собой жизнеспособные альтернативы. При планировании любого эксперимента по вестерн-блоттингу важно помнить, что не существует универсального подхода.

8

Типы мембран

Белки могут быть перенесены на мембраны из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (ПВДФ). Мембраны PVDF обладают высокой механической прочностью и наиболее подходят, когда требуется снятие мембраны и повторное зондирование, как это часто бывает, когда вы используете общий белок в качестве контроля загрузки фосфорилированной мишени. Поскольку ПВДФ обладает более высокой связывающей способностью, чем нитроцеллюлоза, он предпочтительнее для фосфорилированных мишеней с низким содержанием. Однако повышенная связывающая способность ПВДФ также означает, что вы с большей вероятностью увидите более высокие уровни неспецифического связывания и фона по сравнению с нитроцеллюлозой. LF PVDF (низкофлуоресцентный PVDF) также рекомендуется, если вы проводите нормализацию общего белка или используете флуоресцентные вторичные антитела.

9

Мойка

Тип буфера, используемого для выполнения этапов промывки, также может влиять на отношение сигнал/фон. В целом, использование буферов на основе трис-солевого буфера (TBS) часто дает более сильный сигнал по сравнению с буферами на основе фосфатно-солевого буфера (PBS). Обратите внимание, что присутствие ионов фосфата в PBS может мешать сигналу от фосфорилированной мишени. Добавление детергента, такого как Tween 20, в промывочный буфер также помогает удалить материалы, неспецифически связанные с мембраной.

10

анализ ТПС

Нормализация общего белка (TPN) — это метод, используемый для количественного определения количества интересующего вас белка. Это включает нормализацию полосы к уровням общего белка в ваших образцах.

Ниже представлена ​​упрощенная процедура проведения анализа TPN с использованием технологии Bio-Rad без красителей (подробную информацию о процедуре см. на сайте bio-rad.com/6434):

• Загрузите свои образцы на один из гелей Bio-Rad для защиты от пятен. Включите один набор образцов для блоттинга с антителом против общего интересующего белка (анти-тотальное антитело) и второй набор образцов для блоттинга с антителом против фосфорилированной формы интересующего белка (фосфоспецифическое антитело). ). Если вы выполняете мультиплексирование, один набор образцов можно блоттировать как анти-общими, так и фосфо-специфическими антителами.
• Выполните гель-электрофорез (см. bio-rad.com/6390 протокол вестерн-блоттинга рабочего процесса V3)
• Сделайте изображение геля без пятен с помощью системы Bio-Rad ChemiDoc Imager System и программного обеспечения Image Lab (рис. 3). Технология получения изображений без окрашивания работает быстро — соединения тригалогена, включенные в гель, заставляют белки флуоресцировать при фотоактивации (Yadav and Liu 2014), при условии, что белок содержит по крайней мере два остатка триптофана.

Технология визуализации без окрашивания позволяет нормализовать полосы по общему белку на каждой дорожке (Taylor et al. 2013). На этом этапе необходимо активировать гель для последующей визуализации мембраны без окрашивания.

Рис. 3. Изображение технологии без окрашивания. Мембрана была визуализирована с помощью сканера без окрашивания перед хемилюминесцентным обнаружением.

• Блот-мембраны с соответствующими антителами против общих и фосфоспецифических антител
• После блоттинга сделайте изображения блотов без пятен
  При использовании хемилюминесцентного обнаружения сделайте изображения блотов без пятен перед добавлением реагентов ECL
• Рассчитайте нормализованную интенсивность для общего и фосфорилированного интересующего белка с помощью TPN
  Используйте программное обеспечение Image Lab для расчета нормализованной интенсивности TPN для общего белка и фосфоспецифических полос интересующего белка. Посетите сайт bio-rad.com/6434, чтобы узнать больше о TPN.
• Определите количество фосфорилированной формы интересующего белка относительно количества общего белка для каждого образца
  Для этого разделите нормализованную по TPN интенсивность сигнала фосфорилированной формы интересующего -специфическое антитело) по нормализованной по TPN интенсивности сигнала интересующего общего белка (обнаруженной с помощью анти-суммарного антитела). Выполните этот расчет отдельно для каждого из анализируемых образцов (рис. 4).

Рис. 4. Нормализованная интенсивность сигнала EGF R (pTyr1148) из лизатов, обработанных и необработанных EGF, обработанных (+) или без (-) лямбда-протеинфосфатазы. Лямбда-протеинфосфатаза дефосфорилирует остатки серина, треонина и тирозина. Нормализованную интенсивность сигнала рассчитывали путем деления интенсивности сигнала, нормализованной по TPN, для каждого фосфопротеина на нормированную по TPN интенсивность соответствующего общего белка.

Чтобы овладеть наукой и искусством вестерн-блоттинга, посмотрите наши вебинары с полезными советами о факторах, которые имеют решающее значение для успеха ваших вестерн-блоттингов, на info.bio-rad.com/ww-PQDвебинары

Похожие темы

• Иммунопреципитационные антитела
• Антитела PrecisionAb для вестерн-блоттинга
• Дополнительные реагенты для вестерн-блоттинга
• Магнитные шарики SureBeads Protein A
• Магнитные шарики SureBeads Protein G
• Фосфоспецифические прецизионные антитела

Опора

• Свяжитесь с нашим отделом технической поддержки
• Ресурсы вестерн-блоттинга
• Реагент для обнаружения TidyBlot WB: листовка HRP
• Реагент TidyBlot: часто задаваемые вопросы

использованная литература

• Области РК (1994).