Ингибирующие вещества в молоке: Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГБУ ВНИИЗЖ) г.Москва

Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГБУ ВНИИЗЖ) г.Москва

     К ингибирующим веществам относятся антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны, нитраты, консервирующие (формалин, перекись водорода), нейтрализующие (сода, гидроокись натрия, аммиак), моющие, дезинфицирующие средства.

     Особую опасность для людей и серьезную проблему для молочной промышленности представляет наличие остаточных количеств антибиотиков, поскольку они могут нарушить производственный процесс, ингибируя заквасочную микрофлору. Это приводит к серьезным финансовым потерям. Но наиболее опасны последствия попадания остатков антибиотиков в организм человека.

     На проявление ингибирующих свойств молока влияют самые различные факторы. Возможными источниками попадания ингибиторов являются: нарушения в браковке молока при лечении животных; санитарная обработка доильного и молочного оборудования; использование некачественных кормов; попадание ряда химических веществ с кормом.

     Отмечено проявление положительной реакции на присутствие ингибирующих веществ в стародойном молоке коров в предзапускной период. Количество такого молока увеличивается со сроком стельности коров: чем глубже стельность, тем выше процент выявления положительных реакций на ингибиторы. Для устранения влияния примеси молока коров запускного периода на качество не допускается его смешивание с молоком общего удоя в последние две недели перед началом сухостойного периода.

     На ингибирующие свойства молока могут влиять кормление коров и качество кормов, наличие повышенного содержания нитратов или нитритов в кормах. Следует строго соблюдать дозировку химических реагентов при консервировании силоса.

     В животноводстве широко используются противомикробные средства, стимуляторы роста, во многих кормовых добавках применяются антибиотики. Их вносят также при изготовлении заменителей цельного молока для телят. В связи с этим лактирующим коровам не подлежат скармливанию комбикорма, предназначенные для других видов животных и производственных групп крупного рогатого скота.

     Для лактирующих коров необходимо балансировать рационы по микроэлементам. При избыточном поступлении в организм коров ряда микроэлементов увеличивается их концентрация в молоке, и могут проявиться ингибирующие свойства. Не допускается превышение дозы калия, йода. Их корректируют в зависимости от содержания йода в комбикормах, смеси микроэлементов (полисоли).

     При скармливании в рационе выдерживают сахаропротеиновое соотношение (1:1-1:2).

     С целью предотвращения попадания остаточных количеств моющих, моюще-дезинфицирующих и дезинфицирующих средств в молоко и возможного их влияния на результаты определения ингибирующих веществ, санитарную обработку доильного и молочного оборудования необходимо проводить строго в соответствии с нормами. В случае появления положительных реакций на присутствие остаточных количеств санитарных средств на поверхности доильного и молочного оборудования, необходимо провести его повторное ополаскивание водой.

     Возможны положительные реакции на присутствие ингибиторов в молоке в результате вакцинации лактирующих коров (против сибирской язвы) препаратами, содержащими антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны. Один из путей, способствующих попаданию антибиотиков и других лекарственных препаратов в молоко — их внутримышечное введение. Это особенно опасно при лечении коров, больных маститом. Большинство противомаститных препаратов содержат антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны. После прекращения лечения они определенное время сохраняются в организме и выводятся вместе с молоком. В этом случае при нарушении сроков браковки молока происходит наиболее сильное загрязнение остатками лекарств. В связи с этим необходимо в период лечения коров выдаивать отдельно, а молоко браковать, соблюдая различные сроки браковки при лечении разными препаратами. Профилактические мероприятия по предотвращению заболеваний коров маститом желательно проводить в сухостойный период.

     Разные антибиотики обладают различным аллергическим, токсическим действием и характером влияния на микрофлору. Существует специфичность в чувствительности микроорганизмов к действию одного и того же антибиотика, что необходимо учитывать при подборе производственно-ценных культур в составе заквасок для молочных продуктов. Например, пенициллин обладает самой высокой антигенной активностью. По данным ММФ, аллергическая реакция на пенициллин свойственна 1-5 % людей. Аллергическую реакцию по отношению к другим антибиотикам наблюдают лишь изредка. В то же время пенициллин практически не токсичен, а стрептомицин, тетрациклин и, прежде всего, хлорамфеникол, токсичны. Стрептомицин оказывает токсичное действие на центральную и периферическую нервную систему. Тетрациклин вызывает изменение состава крови, повреждение паренхимы печени и токсикоз нервной системы. Все антибиотики обладают иммунодепрессивным действием. Отрицательное действие различных антибиотиков на микрофлору проявляется в разной степени в изменении ее состава или в появлении у микробов резистентности к ним.

     Решение рассматриваемой проблемы во многом зависит от разработки и внедрения высокоэффективных, обладающих высокой специфичностью методов контроля на присутствие ингибирующих веществ. Помимо установления наличия ингибирующих вещества в молоке, важно определить его тип. Это позволит проанализировать ситуацию и выяснить возможный источник попадания данного вещества в молоко.

     Лаборатории Россельхознадзора постоянно проводят лабораторные исследования на определение конкретных ингибирующих веществ в пробах сырого молока, отобранных в рамках Плана государственного мониторинга качества и безопасности пищевых продуктов, контрольно-надзорных мероприятий, а также по обращению владельцев продукции при выполнении программы производственного контроля.


Читать также:

подробнее

подробнее

подробнее

Определение ингибирующих веществ в молоке по ГОСТ Лабораторное оборудование для мясо-молочной промышленности

Исследование молока на наличие ингибирующих веществ – необходимый этап при контроле качества, так как молоко, содержащее данные вещества, не подходит для приема в пищу и для дальнейшей переработки. К ингибиторам относятся антибиотики, пестициды, моющие средства, консервирующие (перекись водорода, формалин) и нейтрализующие (аммиак, сода) вещества.

В чем заключается опасность ингибиторов?

Молоко, содержащее ингибирующие вещества, нельзя использовать в пищу или для дальнейшей переработки. Ингибирующие вещества могут как нанести серьезный вред здоровью человека, так и нарушить процесс производства.

Так, антибиотики вызывают аллергические реакции у человека и вырабатывают устойчивость к их применению, что может затруднить лечение воспалительного процесса. При этом стрептомицин и тетрациклин токсичны. Стрептомицин негативно влияет на нервную систему, а тетрациклин вызывает повреждения печени, нарушения в работе нервной системы и изменение состава крови.

Антибиотики влияют и на производственный процесс, ингибируя микрофлору, что приводит к финансовым потерям. При производстве сыра и творога антибиотики нарушают сычужное свертывание молока, что приводит к ухудшению качества конечного продукта.

Пестициды так же оказывают негативное воздействие на организм человека. Наличие абсолютного большинства пестицидов не допускается, а уровень хлорорганических пестицидов не должен превышать 0,05 мг/л.

Моющие средства негативно влияют на процесс сквашивания при производстве кисломолочных продуктов и сыра.

Как избежать попадания ингибиторов в молоко?

На попадание ингибиторов в молоко влияет множество факторов: неправильная санитарная обработка оборудования, попадание химических веществ с кормом, нарушения в браковке молока при лечении животных, фальсификация.

Антибиотики обычно попадают в молоко при нарушении сроков браковки молока коровы, проходившей лечение. Наиболее часто с помощью антибиотиков лечат мастит. Большинство противомаститных препаратов содержат антибиотики, которые какое-то время сохраняются в организме коровы и выводятся с молоком. Чтобы избежать попадания антибиотиков, необходимо отдельно доить коров, проходящих лечение, а их молоко нужно подвергать браковке с соблюдением необходимых сроков.

Пестициды содержатся в различных лечебных препаратах, например, для лечения фасциолеза и заболеваний, вызываемых личинками кожного овода. Чтобы избежать их попадания в молоко, необходимо обрабатывать только пораженные места.

Ингибирующие вещества могут попасть в молоко из-за неверной дозировки химических веществ при консервировании силоса, поэтому необходимо тщательно следить за их количеством.

Моющие средства могут попасть в молоко при нарушениях правил санитарной обработки доильного и молочного оборудования. Чтобы этого избежать, необходимо проверять поверхность на наличие остаточных моющих средств и тщательно ополаскивать оборудование.

Иногда ингибирующие вещества (сода, перекись водорода, аммиак) могут попасть в молоко вследствие фальсификации продукта. Их добавляют, чтобы нейтрализовать молочную кислоту, предохранить молоко от сквашивания, уничтожить афлатоксины.

Определение ингибирующих веществ в соответствии с требованиями ГОСТ

Определение ингибирующих веществ в молоке осуществляется в соответствии с ГОСТ 23454-2016. В рамках данного ГОСТ используется 3 методики.

  • Метод с использованием тест-культуры термофильного стрептококка и индикатора резазурина. Данный метод основан на исследовании тест-культуры Streptococcus thermophilus В19 и восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По окраске резазурина определяют наличие или отсутствие ингибирующих веществ в молоке. Если окраска остается серо-сиреневой или сиреневой, то ингибирующие вещества присутствуют в молоке.
  • Метод с использованием стандартного диффузного теста Delvotest T. Данный метод предполагает анализ изменения окраски агаровой среды с фиолетовой на желтую при отсутствии ингибирующих веществ и сохранении фиолетовой окраски при их наличии.
  • Метод с использованием BRT-inhibitor теста. Как и предыдущий метод, основан на анализе изменений окраски агаровой среды с фиолетовой на желтую при отсутствии ингибиторов и сохранении фиолетовой окраски при наличии.

BAM Глава 20A: Ингибирующие вещества в молоке

Bacteriological Analytical Manual (BAM) Main Page

Январь 2001 г.

Автор: Ларри Дж. Мэтьюрин (в отставке)

За дополнительной информацией обращайтесь к Равиндеру Редди

Два метода обнаружения в молоке веществ, ингибирующих микробы метод цилиндрической пластины с использованием Micrococcus luteus в качестве тест-организма и метод бумажного диска с использованием Bacillus stearothermophilus . Метод цилиндрической пластины, который является официальным методом количественного обнаружения остатков β-лактама (3), описан в Главе 16, Молочные продукты, в Официальных методах анализа (2). Аналитик также должен обратиться к Главе 42, Наркотики в кормах ( Официальные методы ), для приготовления сред и некоторых других подробностей. Весь метод представлен здесь для удобства.

Описание метода цилиндрической пластины для обнаружения пенициллина в сухом сухом молоке дано Крамером и др. (6). Та же основная процедура может быть применена к анализу пенициллина в жидком молоке. Обычное цельное молоко используется в качестве контрольного разбавителя вместо контрольного разбавителя из сухого сухого молока и буфера, указанного в процедуре подготовки стандартной кривой. Обычное цельное молоко, которое должно служить в качестве контрольного разбавителя, должно быть протестировано перед использованием, чтобы убедиться, что оно не проявляет антибактериальной активности в отношении тестируемого организма. Подготовка проб не требуется; Образцы молока, представляемые на экспертизу, тестируются сразу после их получения. Во всех случаях образцы молока должны быть свежими. Если подозревается, что образец молока содержит пенициллин на уровне более 0,2 ЕД/мл, его следует разбавить контрольным разбавителем до расчетной концентрации 0,05 ЕД/мл перед тестированием. Все остальные части процедуры остаются прежними. Дисковый метод, который является официальным методом качественного определения ингибирующих веществ в молоке (1), является модификацией метода, одобренного Международной молочной федерацией для качественного определения пенициллина в молоке (4).

Micrococcus luteus Метод цилиндрической пластины

  1. Оборудование и материалы
    1. Цилиндры из нержавеющей стали, 8 + 0,1 мм внеш., 6 + 0,1 мм внутр., 10 + 0,1 мм в длину. Можно приобрести в S&L Metal Products Corp., 58-29 57th Drive, Maspeth, NY 11378.
    2. Дозатор цилиндров Shaw. Доступен в E.C. Condit, стр. 0. Box 75, Middle Haddam, CT 06456, или Arthur E. Farmer, P.O. Box 1785, Трентон, Нью-Джерси 08618.
    3. Чашки Петри, 20 × 100 мм, с фарфоровыми крышками, глазурованные снаружи, или крышки с фильтрующими прокладками, способными поглощать воду синерезиса. При желании можно использовать сопоставимые пластиковые чашки Петри. Можно использовать пластиковые крышки, если они слегка приподняты для выхода воды.
  2. Среды и реагенты
    1. Антибиотическая среда № 1 (M14). Агар для семян Penassay (Difco) и агар для семян (BBL) являются удовлетворительными.
    2. Антибиотическая среда № 4 (М15). Мясо-дрожжевой агар (Difco и BBL) удовлетворительны.
    3. Фосфатный буфер, 1% (pH 6,0 + 0,1). Растворяют 8,0 г одноосновного фосфата калия и 2,0 г двухосновного фосфата калия в дистиллированной воде и доводят дистиллированной водой до 1 л.
    4. Пенициллиназа (β-лактамаза) (R55). Доступен в Difco Laboratories, Box 1058A, Detroit, MI 48232; ББЛ, отд. компании BioQuest, P.O. Box 243, Кокисвилль, Мэриленд, 21030; ICN Nutritional Biochemicals, 26201 Miles Road, Cleveland, OH 44128; Шварц/Манн, Оринджбург, Нью-Йорк 10962; Calbiochem, 10933 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037.
    5. Рабочий стандарт пенициллина G. Аутентичный эталонный стандарт пенициллина G можно получить в U.S.P. Справочные стандарты, 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852. Следуйте инструкциям по приготовлению и хранению. Готовят исходные растворы, тщательно взвешивая в атмосфере с влажностью 50 % или менее небольшое количество стандартного порошка и разбавляя взвешенный порошок соответствующим разбавителем для получения раствора подходящей концентрации.
    6. Физиологический раствор, 0,85% (стерильный) (R63)

  3. Препарат Micrococcus luteus

    Культуры Micrococcus luteus (ATCC 9341) можно получить в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Сохраняйте исходную культуру на скошенных агаризованных средах с антибиотиками № 1 и пересаживайте на свежий скошенный срез примерно раз в 2 недели. Суспензию готовят следующим образом: на скошенный агар обильно наносят тест-организмы и инкубируют 18–24 ч при 32–35°C. Промыть нарост со скоса 1-2 мл стерильного физиологического раствора и перенести на сухую поверхность флакона Ру, содержащего 300 мл Антибиотической среды № 1. Равномерно распределить суспензию по всей поверхности с помощью стерильных стеклянных шариков. Инкубировать 18-24 ч при 32-35°С. Промойте рост с поверхности агара 50 мл физиологического раствора. Перед фактическим анализом подготовьте пробные чашки, чтобы определить оптимальное количество основной суспензии, которую нужно добавить в посевной агар, чтобы получить наилучшие зоны ингибирования. Как правило, это колеблется от 0,1 до 0,5 мл инокулята на 100 мл Антибиотической среды № 4. Храните эту исходную суспензию в холодильнике не более 2 недель.

  4. Подготовка пластин

    Добавьте 10 мл Antibiotic Medium No. 1 в каждую чашку Петри. Равномерно распределите средство и дайте затвердеть на плоской ровной поверхности. Расплавляют Антибиотическую среду № 4, охлаждают до 48°С и добавляют оптимальное количество культуры на 100 мл, как определено выше. Тщательно перемешайте. Добавьте 4,0 мл этого инокулированного агара в каждую чашку. Равномерно распределите агар, наклоняя чашки из стороны в сторону круговыми движениями. Дайте затвердеть. Используйте тарелки в тот же день, когда они были приготовлены.

  5. Подготовка стандартной кривой

    Приготовьте маточный раствор пенициллина G путем растворения точной навески стандарта пенициллина в достаточном количестве фосфатного буфера (B-3, выше) до получения раствора, содержащего 1000 единиц/мл. Этот исходный раствор можно использовать в течение 2 дней. Готовят контрольный разбавитель из фосфатного буфера и сухого молока без антибиотиков из расчета 3 мл буфера на 1,0 г молока. Далее разбавьте исходный раствор пенициллина G в контрольном разбавителе для получения концентраций 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 и 0,2 ЕД/мл. Референтная концентрация 0,05 ед/мл. Поместите 6 цилиндров на равном расстоянии друг от друга на засеянную агаром поверхность подготовленных чашек Петри (D, вверху). Наполните 3 цилиндра стандартным раствором 0,05 ед/мл и 3 цилиндра стандартом одной другой концентрации, чередуя так, чтобы за каждым цилиндром 0,05 ед/мл следовал цилиндр другой концентрации. Используйте 3 пластины для каждой точки кривой, всего 15 пластин. 3 планшета, содержащие самую низкую концентрацию стандарта (0,00625 ЕД/мл), предназначены для получения отрицательных результатов; остальные 12 пластин используются для построения стандартной линии ответа. Это дает 45 определений для 0,05 ед/мл и 9определения для каждой из других точек на прямой.

    Замените крышки и инкубируйте чашки в течение 16-18 часов при 30°C. После инкубации переверните планшеты, чтобы удалить цилиндры. Измерьте диаметр каждой зоны ингибирования как можно точнее (по крайней мере, с точностью до 0,5 мм). Средние показания концентрации 0,05 ед/мл и точечные тесты на каждом наборе из 3 планшетов. Также усредните все 45 показаний концентрации 0,05 ед/мл, чтобы получить точку коррекции для кривой.

    Исправить среднее значение для каждой точки до значения, которое было бы, если бы среднее значение 0,05 ед./мл для набора из 3 планшетов было таким же, как точка коррекции. Пример: если среднее из 45 показаний концентрации 0,05 ед/мл составляет 20 мм, а среднее значение девяти цилиндров 0,05 ед/мл на наборе из трех планшетов 0,025 ед/мл равно 190,8 мм, поправка +0,2 мм. Если среднее значение для девяти цилиндров 0,025 ЕД/мл на этих 3 планшетах составляет 17,0 мм, скорректированное значение составляет 17,2 мм. Нанесите скорректированные значения, включая среднее значение концентрации 0,05 ед/мл, на 2-цикловой полулогарифмической миллиметровой бумаге, поместив концентрацию в ед/мл в логарифмическом масштабе и диаметр зоны ингибирования в арифметическом масштабе. Постройте наилучшую прямую линию через эти точки либо путем осмотра, либо с помощью следующих уравнений:

    , где L и H = рассчитанные диаметры зон для самой низкой и самой высокой (0,0125 и 0,2 ед/мл) концентрации линии стандартного ответа; c = средний диаметр зоны из 45 диаметров зоны для эталонной концентрации; и a, b, d, e = скорректированные средние диаметры зон для каждой из других концентраций, используемых для стандартной линии отклика.

  6. Подготовка пробы

    Точно взвесьте 10 г образца сухого молока и добавьте 30 мл фосфатного буфера (B-3, выше). Тщательно перемешайте. Если ожидается концентрация пенициллина G более 0,2 ед/мл в этой смеси, разбавьте аликвоту восстановленного сухого молока контрольным разбавителем (Е, выше) до расчетной концентрации 0,05 ед/мл. Чтобы определить активность пенициллина, возьмите часть образца, добавьте концентрат пенициллиназы (B-4, выше) из расчета 0,5 мл/10 мл образца и инкубируйте 30 мин при 37°C. На 3 планшетах заполните 2 цилиндра эталонным стандартом ед. /мл. 2 цилиндра с необработанным образцом и 2 цилиндра с образцом, обработанным пенициллиназой. Инкубируйте чашки и следуйте той же процедуре, что и в E выше. Зона ингибирования с необработанным образцом и отсутствие зоны с образцом, обработанным пенициллиназой, является положительным тестом на пенициллин G.

  7. Расчет потенции

    Усреднение зональных показаний стандарта и зональных показаний образца на 3 пластинах. Если средний размер зоны образца больше среднего для стандарта, добавьте разницу между ними к размеру зоны эталонного стандарта на кривой. Если среднее значение образца ниже стандартного значения, вычтите разницу между ними из размера зоны эталонного стандарта на кривой. По кривой прочтите концентрацию, соответствующую этому скорректированному размеру зоны пробы. Умножьте концентрацию в единицах/мл на коэффициент разбавления 4Х, чтобы получить конечную концентрацию пенициллина G в единицах/г. Если образец порошка был дополнительно разбавлен, необходимо учитывать соответствующий коэффициент разбавления при расчете конечной активности.

  8. Элементы управления

    При использовании этих процедур анализа аналитик должен быть уверен, что любая обнаруженная антибиотическая активность связана с образцом, а не с условиями окружающей среды (включая аналитика), оборудованием или используемыми реагентами. Надлежащая лабораторная практика требует, чтобы на протяжении всего аналитического процесса осуществлялся надлежащий контроль. Они всегда должны включать средства контроля для указания степени прецизионности и правильности определений, о которых следует сообщать. Самая низкая стандартная концентрация (0,00625 ЕД/мл) предназначена для использования в качестве контроля, который может давать отрицательные результаты. Эта самая низкая концентрация представляет собой контрольный разбавитель, к которому было добавлено лекарство на уровне, который обычно ниже предела обнаружения. Иногда самая низкая концентрация (0,00625 ЕД/мл) дает измеримую зону ингибирования. Следующая по величине концентрация (0,0125 ЕД/мл) всегда должна давать положительный результат. Чувствительность этого анализа обычно составляет 0,01 ед/мл. Контрольный разбавитель всегда должен давать отрицательный результат.

Bacillus stearothermophilus Дисковый анализ — Качественный метод II

  1. Оборудование и материалы
    1. Индикаторный агар PM (M6)
    2. Триптиказный (триптический) соевый бульон без декстрозы (М154)
    3. Триптиказный (триптический) соевый агар (M152)
    4. Чашки Петри (см. A-3 выше)
    5. Бумажные диски, 12,7 мм (Schleicher & Schuell)
    6. Пенициллиназа (β-лактамаза) (R55)
    7. Диски управления. Ежедневно готовят свежее молоко из положительного контроля, содержащего 0,008 ЕД/мл пенициллина.
    8. Пипетка 90 мкл с одноразовыми наконечниками
    9. Штангенциркули
    10. Пинцет с тонкими кончиками

  2. Рабочий стандарт пенициллина G

    Точно взвесить в атмосфере с относительной влажностью менее 50 % около 30 мг U.S.P. эталонный стандарт натрия пенициллина G (USP). Растворить в достаточном количестве фосфатного буфера, чтобы получить исходную концентрацию 100-1000 единиц/мл. Хранить в темноте в течение <2 дней="" по адресу="">

  3. Подготовка Bacillus stearothermophilus

    Культуры B. stearothermophilus var. calidolactis (ATCC 10149) (5) можно получить в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Поддерживайте скошенный триптиказо-соевый агар и пересаживайте еженедельно. Приготовьте суспензию спор следующим образом: инокулируйте три колбы Эрленмейера на 300 мл, каждая из которых содержит 150 мл триптиказо-соевого бульона без декстрозы. Инкубируйте колбы при 64 ± 2°C. Периодически делайте окрашивание спор, чтобы определить степень спорообразования. Когда произошло достаточное спороношение (около 80%, обычно за 72 ч), центрифугируют клетки 15 мин при 5000 об/мин. Слить супернатант, ресуспендировать клетки в физиологическом растворе и центрифугировать; повторение. После удаления супернатанта после окончательной промывки клетки суспендируют в 30 мл физиологического раствора и хранят при 0-4,4°C. Споровая суспензия сохраняет жизнеспособность 6-8 месяцев. Коммерчески приготовленная суспензия спор удовлетворительна. Периодически проверяйте жизнеспособность, готовя пробные тестовые пластины.

  4. Приготовление стандартного раствора молока

    Приготовьте стандартный молочный раствор путем разведения исходного раствора пенициллина G в молоке, не содержащем ингибиторов, до концентрации 0,008 ЕД/мл. Хранить при температуре 0-4,4°C не более 2 суток или распределять небольшими порциями и замораживать в незамерзающем морозильнике. Хранить в замороженном виде не более 6 месяцев. Положительные контроли Difco PM и стандарты пенициллина Penicillin Assay, Inc. удовлетворительны.

  5. Подготовка пластин

    Инокулировать индикаторный агар PM, охлажденный до 64°C, предварительно приготовленной суспензией спор B. stearothermophilus (C, вверху). Отрегулируйте уровень инокулята, чтобы обеспечить 1 × 10 6 спор/мл. Внесите пипеткой по 6 мл засеянного агара в каждую чашку Петри и дайте затвердеть на ровной поверхности. Используйте чашки в свежем виде или храните в герметичных пластиковых мешках при температуре 0–4,4 °C и используйте в течение 5 дней после приготовления.

  6. Анализ — Скрининг

    Используйте пипетку на 90 мкл. Надежно закрепив наконечник и расположив пипетку вертикально, полностью нажмите на поршень до первого упора. Вставьте наконечник на 1 см ниже поверхности хорошо перемешанного образца (при необходимости наклоните образец, чтобы избежать образования пены). Медленно отпустите поршень, чтобы правильно заполнить наконечник. (Если поршень будет отпущен слишком быстро, количество взятого молока будет неравномерным. Если наконечник не заполнен должным образом после отпускания поршня, повторите описанную выше процедуру.) С помощью чистых сухих щипцов извлеките и поместите пустой диск (в указанный участок). на поверхности агара, слегка прижимая диск пинцетом, чтобы обеспечить хороший контакт. Немедленно доставьте образец на диск. Удерживая пипетку вертикально кончиком приблизительно на 1 см выше центра диска, медленным, непрерывным движением надавите на поршень до первой остановки. При полностью нажатом плунжере (перейдите ко второму упору, если он есть) один раз коснитесь наконечником центра диска. Обратите внимание, что наконечник пуст, прежде чем выбрасывать. (Повторите описанное выше для всех образцов.) Подготовьте контрольный диск, содержащий 0,008 единиц пенициллина/мл, как и для указанных выше образцов.

    В качестве альтернативы, чистыми сухими щипцами коснитесь бумажным диском поверхности хорошо перемешанного молока. (Встряхните необработанные образцы, встряхнув 25 раз за 7 с по дуге 1 фут, или полностью переверните потребительские контейнеры 25 раз. Дайте пузырькам лопнуть перед отбором проб. Образец должен быть взят в течение 3 минут после перемешивания.) Дайте молоку впитаться под действием капиллярных сил. Слейте лишнее молоко, один раз прикоснувшись краем диска к внутренней поверхности стерильной крышки чашки Петри. Немедленно поместите диск на поверхность агара, слегка нажимая, чтобы обеспечить хороший контакт. (Повторите вышеприведенное для всех образцов.) Поместите контрольный диск, содержащий 0,008 единиц пенициллина/мл, на поверхность агара, как указано выше (если несколько чашек, меняйте положение контроля на каждой чашке, в центре или на краю). Определите каждый диск или раздел, на котором он размещен. (Поместите максимум 7 дисков на тарелку, 6 краев и 1 центр.)

    Перед тем, как перевернуть чашку(и), убедитесь, что диски полностью и равномерно заполнены, наблюдая через дно чашки Петри на источнике света. Также убедитесь, что за краем дисков не видно молока. Переверните планшеты и инкубируйте при 64 ± 2°C до получения четко выраженных зон ингибирования (16–20 мм) с контролем 0,008 ЕД/мл (2,5–3,5 ч). Осмотрите пластину (тарелки) на наличие четкой зоны (зон) торможения вокруг дисков. (Измерьте зону (зоны) штангенциркулем.) Чистые зоны размером 14 мм указывают на присутствие ингибирующих веществ. Зоны <14 мм считываются как отрицательные. Зоны 16 мм должны быть подтверждены наличием ингибитора.

  7. Анализ — Подтверждение

    Нагрейте испытуемый образец до 82°C в течение >2 мин и быстро охладите до комнатной температуры. Используйте пипетку на 90 мкл или, альтернативно, чистыми сухими щипцами прикоснитесь бумажным диском к поверхности хорошо перемешанного молока и дайте молоку впитаться под действием капиллярных сил. Добавьте 0,05 мл пенициллиназы к 5 мл образца и заполните диск. Слейте лишнее молоко, прикоснувшись диском к внутренней поверхности стерильной чашки Петри. Немедленно поместите каждый диск на поверхность агара, слегка нажимая, чтобы обеспечить хороший контакт. Поместите контрольный диск, содержащий 0,008 Ед/мл, на планшет или используйте 9Пипетка на 0 мкл (F, выше). Переверните планшет и инкубируйте при 64 ± 2°C до получения четко выраженных зон ингибирования (16–20 мм) с контролем 0,008 ед/мл. Осмотрите планшет на наличие четкой зоны ингибирования (> 16 мм), окружающей диск, что указывает на наличие ингибирующего вещества.

  8. Интерпретация. Анализ исследуемого молока при скрининге и подтверждающем тесте может дать следующие результаты:
    • Отсутствие зоны вокруг диска, содержащей необработанное молоко, в скрининговом тесте является отрицательным тестом на ингибирующие вещества.
    • Зона вокруг диска, содержащая необработанное молоко, но отсутствие зоны вокруг диска, содержащей молоко, обработанное пенициллиназой, в подтверждающем тесте является положительным тестом на наличие остатка β-лактама.
    • Чистая зона одинакового размера вокруг обоих дисков в подтверждающем тесте указывает на присутствие ингибиторов, отличных от остатков β-лактама.
    • Чистая зона шириной 4 мм вокруг обработанного пенициллиназой молока меньше, чем вокруг необработанного молочного диска в подтверждающем тесте, что указывает на присутствие остатков β-лактама, а также другого(их) ингибитора(ов).

    Положительный контрольный раствор пенициллина с концентрацией 0,008 ЕД/мл должен давать четкие, четко очерченные зоны ингибирования (16–20 мм). Если при положительном к пенициллину контроле зона ингибирования не образуется, чувствительность теста недостаточна, и его следует повторить.

Ссылки

  1. Ассоциация официальных химиков-аналитиков. 1982. Изменения в методах. Дж. Доц. Выключенный. Анальный. хим. 65 :466-467.
  2. Ассоциация официальных химиков-аналитиков. 1984. Официальные методы анализа, 14-е изд., сек 16.163; 42.299-42.303. AOAC, Арлингтон, Вирджиния.
  3. Свод федеральных правил. 1976. Название 21, с. 436.105, Типография правительства США, Вашингтон, округ Колумбия.
  4. Международная молочная федерация. 1970. Обнаружение пенициллина в молоке методом дискового анализа. Международная молочная федерация, Брюссель, Бельгия.
  5. Kabay, A. 1971. Быстрый количественный микробиологический анализ антибиотиков и химических консервантов неантибиотической природы. Заяв. микробиол. 22 :752-755.
  6. Крамер, Дж., Г.Г. Картер, Б. Аррет, Дж. Уилнер, В.В. Райт и А. Киршбаум. 1968. Остатки антибиотиков в молоке, молочных продуктах и ​​тканях животных: методы, отчеты и протоколы. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Вашингтон, округ Колумбия.

 

Гипертекст Источник: Ингибирующие вещества в молоке, Бактериологическое аналитическое руководство, 8-е издание, редакция A, 1998 г. Глава 20A.

 

Ингибирующее вещество, присутствующее в молоке

  • Опубликовано:
  • G. C. CHEESEMAN 1 и
  • D. J. JAYNE-WILLIAMS 1  

Природа
том 204 , страницы 688–689 (1964)Цитировать эту статью

  • 47 доступов

  • 14 цитирований

  • Сведения о показателях

Abstract

ВО ВРЕМЯ исследования эффективности установок для сверхвысокой температуры стерилизации Франклин и др. 1 наблюдал, что тестируемый организм, штамм Bacillus stearothermophilus , ингибировался подогретым молоком. Ингибирование стало очевидным, когда были проведены сравнения извлечений, полученных при прямом подсчете на чашках и при подсчете с разбавлением, при котором в качестве разбавителя использовалось стерилизованное при сверхвысокой температуре молоко; аналогичный, но более слабый эффект на споры B. subtilis был ранее отмечен Franklin et al. 2 .

Это предварительный просмотр содержимого подписки, доступ через ваше учреждение

Варианты доступа

Подписаться на журнал

Получить полный доступ к журналу на 1 год

199,00 €

всего 3,90 € за выпуск

Подписаться

Расчет налогов будет завершен во время оформления заказа.

Купить статью

Получите ограниченный по времени или полный доступ к статье на ReadCube.

$32,00

Купить

Все цены указаны без учета стоимости.

Ссылки

  1. Franklin, J.G., Williams, D.J., Burton, H., Chapman, H.R., and Clegg, L.F.C., Intern. молочный конгр. , Лондон, 1 , 410 (1959).

    Google Scholar

  2. Franklin, J.G., Williams, D.J., and Clegg, L.F.C., J. App. Бакт. , 21 , 47 (1958).

    Артикул

    Google Scholar

  3. Jayne-Williams, D. J., J. App. Бакт. , 26 , 403 (1963).

    Google Scholar

Ссылки на скачивание

Информация об авторе

Авторы и организации

  1. Национальный институт исследований молочного животноводства, Университет Рединга,

    Г. К. ЧИЗМАН и Д. Дж. ДЖЕЙН-УИЛЬЯМС

Авторы

  1. G.